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Nov 14, 2023

De nouvelles connaissances sur la culture en raceway d'Euglena gracilis sous de longues

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7123 (2023) Citer cet article

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Cette étude visait à étudier les réponses physiologiques d'Euglena gracilis (E. gracilis) lorsqu'il est soumis à une privation semi-continue d'azote (N-) pendant une période prolongée dans des étangs ouverts. Les résultats ont indiqué que les taux de croissance d'E. gracilis sous la condition N− (11 ± 3,3 gm−2 j−1) étaient plus élevés de 23 % par rapport à la condition N-suffisante (N+, 8,9 ± 2,8 gm−2 j−1 ) condition. De plus, la teneur en paramylon d'E. gracilis était supérieure à 40 % (p/p) de la biomasse sèche en condition N− par rapport à la condition N+ (7 %). Fait intéressant, E. gracilis présentait des nombres de cellules similaires indépendamment des concentrations d'azote après un certain temps. De plus, il a démontré une taille de cellule relativement plus petite au fil du temps et un appareil photosynthétique non affecté sous condition N−. Ces résultats suggèrent qu'il existe un compromis entre la croissance cellulaire et la photosynthèse chez E. gracilis, car il s'adapte aux conditions N− semi-continues sans diminution de son taux de croissance et de sa productivité de paramylon. Notamment, à la connaissance de l'auteur, il s'agit de la seule étude faisant état d'une biomasse élevée et d'une accumulation de produits par une souche sauvage d'E. gracilis dans des conditions N−. Cette capacité d'adaptation à long terme nouvellement identifiée d'E. gracilis peut offrir une direction prometteuse à l'industrie des algues pour atteindre une productivité élevée sans compter sur des organismes génétiquement modifiés.

Euglena gracilis est une algue mobile d'eau douce unicellulaire appartenant à la famille des protistes. Depuis sa découverte dans les années 16601, elle a fait l'objet d'une attention considérable. E.gracilis est un organisme modèle important pour comprendre les mécanismes photosynthétiques et les processus cellulaires eucaryotes, en raison de ses propriétés uniques d'organisation des plastes et des chloroplastes2,3. Dans des conditions de lumière aérobie, E. gracilis subit la photosynthèse et stocke son énergie sous la forme d'un polysaccharide de stockage, le β-1-3-glucane non ramifié appelé paramylon3,4. Dans des conditions sombres anaérobies, E. gracilis convertit le paramylon en esters de cire. Ce sont des lipides monocaténaires composés d'acides gras saturés (acide myristique C14:0, acide palmitique C16:0 et acide stéarique C18:0) et d'alcools (alcool myristylique)4. Les applications d'E. gracilis et de ses bioproduits (paramylon et esters de cire) se retrouvent dans divers domaines tels que les fibres alimentaires, le traitement du diabète, l'amélioration du microbiote intestinal, les compléments alimentaires et les biocarburants5,6,7. Compte tenu de ses applications étendues, E. gracilis s'est imposée comme une microalgue industrielle prometteuse. Plusieurs industries basées sur les algues l'utilisent pour la production à grande échelle d'aliments, de produits de santé et de biocarburants3.

L'industrie des algues est confrontée au défi persistant d'atteindre une productivité élevée de la biomasse et des bioproduits avec de faibles coûts d'exploitation. Bien que les algues présentent des avantages potentiels dans des domaines tels que la production de biocarburants, le traitement des eaux usées, la capture du carbone et l'atténuation du changement climatique, leur productivité reste un obstacle de longue date pour l'industrie8,9,10. Bien que la modulation des conditions environnementales et des nutriments puisse améliorer la formation de bioproduits, elle entraîne souvent une diminution de la productivité de la biomasse7. Dans le cas d'E. gracilis, le paramylon est considéré comme un bioproduit précieux. Son accumulation a été observée dans diverses conditions telles que la privation de nutriments, une salinité élevée, une stimulation électrique, une co-culture avec des bactéries et une culture hétérotrophe5,11,12,13,14,15,16. Les chercheurs ont également tenté une modification génétique pour améliorer la productivité et la teneur en paramylon d'E. gracilis17,18. Malgré de tels efforts pour améliorer la production de biomasse et de bioproduits, il y a toujours un prix élevé à payer en termes de technologie ou d'impact environnemental.

La privation ou la limitation de l'azote (N−) est un traitement rentable et sûr pour induire l'accumulation de bioproduits chez E. gracilis19. Le traitement déclenche des changements métaboliques qui améliorent la recirculation du carbone (fixé par photosynthèse) des protéines vers les composants de stockage tels que les lipides ou l'amidon, ce qui entraîne un mécanisme de stockage d'énergie20,21,22. Cependant, la productivité de la biomasse est généralement réduite dans les conditions N− par rapport aux conditions témoins22,23,24. Diverses études de traitement à l'azote, telles que l'ajout intermédiaire, la privation d'azote en deux étapes, semi-continue et séquentielle, ont été menées pour améliorer à la fois la productivité de la biomasse et des lipides25,26,27,28,29. Néanmoins, ce thème demande à être approfondi. Une étude récente sur la chlorella utilisant une privation d'azote en deux étapes dans des cultures discontinues s'est avérée être un moyen efficace de maintenir une biomasse élevée et riche en lipides29. Seules quelques études ont été menées sur E. gracilis, qui ont révélé que la productivité de la biomasse des organismes diminue dans des conditions limitées en N29,30,31,32. Seules quelques études sur des souches génétiquement modifiées ont réussi à atteindre à la fois une biomasse élevée et une accumulation de bioproduits dans des conditions de limitation de N17,33. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour améliorer l'efficacité de la stratégie de traitement de l'azote afin d'atteindre simultanément une productivité élevée de la biomasse et des bioproduits.

Actuellement, on sait très peu de choses sur la façon dont E. gracilis répond aux conditions semi-continues N−, en particulier sur de longues durées. De plus, il n'y a eu aucun rapport de telles études menées dans des environnements naturels utilisant E. gracilis. Compte tenu de l'importance d'E. gracilis dans l'industrie, il est crucial d'obtenir une culture semi-continue stable et une productivité élevée34. À la lumière de cela, notre étude visait à étudier la croissance et l'accumulation du bioproduit paramylon dans E. gracilis dans des conditions N− semi-continues en utilisant des raceways ouverts (Fig. 1a, b). Les résultats de cette étude pourraient être utiles pour évaluer la faisabilité de l'utilisation de la culture N semi-continue comme méthode de culture d'E. gracilis pour une production commerciale à grande échelle.

Système de culture de 1 m2 utilisé dans cette étude. (a) Configuration de l'étang Raceway montrant les étangs R11 à R16. R11, R14 et R15 ont été maintenus dans des conditions de contrôle (N-suffisant, N +) et R12, R13 et R16 ont été maintenus dans des conditions de manque de N (N-). Ici, l, d et w de la règle représentent la longueur, la largeur et la hauteur de l'étang (en millimètres, mm) à l'intérieur de la paroi de l'étang. L'image a été prise le jour 1 de la culture. (b) Une vue comparative des cultures N+ et N− dans les bassins du raceway. Les images ont été prises au jour 5 de l'expérience.

Les cultures ont été maintenues avec succès pendant 16 semaines sans l'ajout d'une nouvelle culture de semences au cours de la période de culture de quatre mois. Des expériences ont été menées sur une base hebdomadaire de 5 jours pour la condition N− avec disponibilité d'azote pendant deux jours, suivie d'une privation de N pendant trois jours. Dans la condition N +, jusqu'à 20 à 60% de l'azote initial a été consommé au jour 5 (Fig. 2, Fig. 1A supplémentaire). Dans les étangs N- (R12, R13 et R16), l'azote a été complètement consommé au jour 3 et les cultures ont été maintenues sous N- jusqu'au jour 5 (Fig. 1A supplémentaire). Il semble que la quantité de N consommée varie également en raison d'autres paramètres environnementaux. La température et le rayonnement solaire ont varié avec le temps au fur et à mesure que l'expérience progressait vers la fin des 16 semaines. Une diminution du rayonnement solaire moyen et de la température a été observée pendant les jours de pluie et le début de l'hiver (Fig. 2). Cela s'est également reflété dans les données de corrélation de la consommation d'azote (Fig. 1B supplémentaire). L'utilisation de N a montré une corrélation positive modérée entre le rayonnement solaire (r = 0,3) et la température (r = 0,4). De plus, une corrélation positive modérée entre le rayonnement solaire et la température a également été observée, alors qu'ils étaient corrélés négativement avec le temps.

Teneur moyenne en N à partir d'une condition suffisante en N (N +), de la température quotidienne et du rayonnement solaire. Les lignes noires, grises et pointillées représentent respectivement le rayonnement solaire (MJ m−2 jour−1), la température moyenne quotidienne (°C) et la teneur en N (mg L−1) des étangs N+.

Le taux de croissance dans la condition N− était plus élevé (23 %) que dans la condition N+ (Fig. 3a). Les taux de croissance moyens hebdomadaires étaient compris entre 10 et 14 gm−2 j−1 dans la condition N− et 6–12 gm−2 j−1 dans la condition N+. Le taux de croissance moyen pour la culture hebdomadaire tout au long de l'expérience dans les conditions N+ et N− était de 8,9 ± 2,8 gm−2 j−1 et 11 ± 3,3 gm−2 j−1, respectivement. D'après l'analyse statistique, les données sur le taux de croissance du jour 1 n'indiquent aucune différence significative, et la valeur de p a tendance à diminuer avec le temps du jour 1 (G-DF : cadre de données de croissance, G-DF1) vers le jour 4 (G -DF2) (Tableau 1, Fig. 2A supplémentaire). Une différence significative dans les taux de croissance peut être observée au jour 5 (G-DF3) entre les deux conditions (tableau 1, Fig. 2B supplémentaire). Il y avait des différences claires dans les performances de croissance entre les conditions (Fig. 3A, B supplémentaire). Au cours de 4 mois, le nombre de cellules dans la condition N + était initialement supérieur à celui de la condition N-, mais la différence a progressivement diminué avec le temps. À la semaine 10, le nombre de cellules dans les deux conditions semblait être similaire (Fig. 3b, Fig. 4A supplémentaire).

Caractéristiques de croissance d'E. gracilis sous N-suffisant (N +) et N-famine (N-). (a) Comparaison des taux de croissance moyens hebdomadaires entre N+ et N−. ( b ) nombre de cellules et ( c ) diamètre des cellules à la fin de chaque semaine de l'expérience hebdomadaire semi-continue N-. Les cercles vides indiquent les cellules cultivées sous la condition N- et les cercles pleins indiquent les cellules cultivées sous la condition N+. Les astérisques noirs indiquent les périodes de faible taux de croissance. Les astérisques rouges indiquent les semaines où le nombre de cellules, le diamètre et le paramylon n'ont pas été mesurés. Les barres d'erreur pour chaque mesure indiquent l'écart type des valeurs moyennes pour chaque traitement (N+ et N−) sur trois étangs (n = 3).

Le diamètre de la cellule, en revanche, était significativement différent dans la trame de données de diamètre D-DF2 et D-DF3 (tableau 1). Le diamètre cellulaire dans la condition N− était similaire à N + au cours des premières semaines, puis il semblait être plus petit que les cellules N + (Fig. 3c, Fig. 4B supplémentaire). Le schéma des changements de diamètre cellulaire semblait varier du jour 3 au jour 5 de chaque expérience hebdomadaire (Fig. 4B supplémentaire). Le diamètre des cellules cultivées dans les deux conditions (N+ et N–) était positivement corrélé entre elles (r = 0,7) et avec le temps (r = 0,3 et r = 0,0, respectivement) au fur et à mesure qu'il progressait de semaine en semaine dans le 14- expérience d'une semaine (Fig. 4C supplémentaire). De plus, le diamètre cellulaire des conditions N+ et N− est corrélé négativement avec la température (r = − 0,4 et r = − 0,1, respectivement) et le temps au fur et à mesure qu'il progresse jour après jour dans une expérience hebdomadaire (r = − 0,2 et r = − 0,1, respectivement) (Fig. 4C supplémentaire).

Les résultats globaux indiquent que le diamètre des cellules dans des conditions N− a légèrement diminué par rapport aux premières semaines et était comparativement plus petit que le diamètre des cellules N+. Néanmoins, le nombre moyen de cellules (0,6 ± 0,1 × 106 pour N+ , 0,6 ± 0,0 × 106 cellules mL−1 pour N–) et le diamètre (14,2 ± 0,7 µm pour N+, 13,8 ± 0,6 µm pour N–) tout au long de l'expérience étaient plus élevé dans la condition N + que dans la condition N- (Fig. 4D supplémentaire). Une réduction similaire de la croissance d'E. gracilis a été observée dans les deux conditions lorsque le rayonnement solaire et la température étaient faibles (Fig. 2).

L'étude a évalué la fluorescence de la chlorophylle (Chl) et l'efficacité photosynthétique en réponse à la disponibilité de l'azote. Les résultats ont montré que la teneur totale en chlorophylle (Chl a + b) était légèrement inférieure dans les conditions N− par rapport aux conditions N+ (Figs. 1b, 4a). Cependant, la composition en chlorophylle-a (Chl-a) et le schéma de réponse Qy avant et après l'incubation à l'obscurité étaient similaires dans les deux conditions (Fig. 4b – d). De plus, l'analyse ANOVA pour les quatre mesures n'a indiqué aucune différence significative (p > 0,05) entre les deux conditions.

Activité chlorophyllienne et photosynthétique d'E. gracilis cultivée dans des conditions de N-suffisant (N +) et de N-privé (N-). (a) Teneur en chlorophylle totale (Chl) (Chl a + b) mesurée au cours de la dernière semaine (semaine 16) de culture. (b) Pourcentage (%) de chlorophylle-a (Chl-a) présente dans la teneur totale en chlorophylle. Rendement quantique photosynthétique (Qy) mesuré avant (c) et (d) après 1 h d'incubation dans l'obscurité. Les cercles vides représentent la condition N− et les cercles pleins représentent la condition N+. Les barres d'erreur indiquent l'écart type des valeurs moyennes pour chaque traitement (N+ et N−) sur trois étangs (n = 3).

Les résultats ont montré que la teneur en paramylon était plus élevée dans la condition N− par rapport à la condition N+ (Fig. 5a). L'accumulation de paramylon variait de 21,0 à 55,0 % du poids des cellules sèches en condition N−, alors qu'en condition N+, elle était comprise entre 5,0 et 10,0 %. En moyenne, 41,0 ± 13,5% (328,8 ± 182,9 pg cellule-1) de paramylon ont été accumulés dans des conditions N-, tandis que seulement 7,7 ± 3,0% (49,7 ± 23,3 pg cellule-1) ont été accumulés dans des conditions N+. L'accumulation de paramylon a également été observée au microscope sous forme de petits corps granuleux dans les cellules (Fig. 5b).

Paramylon et composition élémentaire particulaire. ( a ) Pourcentage de la teneur totale en glucides représenté en % de paramylon (% p/p de la biomasse sèche) dans E. gracilis cultivé dans des conditions suffisantes en N (N +) et affamées en N (N-). La teneur en paramylon a été mesurée le dernier jour de chaque semaine de l'expérience de culture semi-continue, à l'exception de la semaine 6. Les barres d'erreur indiquent l'écart type des valeurs moyennes de la teneur en paramylon pour chaque traitement (N+ et N−) dans trois étangs ( n = 3). ( b ) Microscopie d' E. gracilis cultivée dans des conditions N + et N - dans des champs clairs et sombres. Les corps de Paramylon peuvent être vus comme de petits corps ovales transparents ou rouges dans des champs clairs et sombres, respectivement. (c) Pourcentage de carbone organique total (TOC) et d'azote (TN) mesuré en moyenne sur trois échantillons hebdomadaires prélevés dans un étang pour chaque traitement (N+ et N−) le dernier jour de chacune des trois semaines. Les barres d'erreur indiquent l'écart type des valeurs moyennes des mesures de COT et de TN pour chaque traitement sur la période de trois semaines (n = 3). Les barres grises indiquent la condition N− et les barres noires indiquent la condition N+.

Les teneurs en azote total (TN) et en carbone total (TC) différaient également entre les conditions N− et N+ (Fig. 5c). Au jour 5, une teneur en azote plus élevée a été observée dans les cellules sous la condition N+ (10,0 ± 0,5 %) par rapport à la condition N− (5,3 ± 1,2 %). En revanche, la teneur moyenne en N dans le milieu acellulaire au jour 5 était inférieure au niveau de détection autour de 0 mg L−1 en condition N−, et 44,8 ± 13,6 mg L−1 en condition N+, indiquant un rapport plus élevé d'azote dans la cellule au milieu en condition N− par rapport à la condition N+.

À la fin de l'expérience hebdomadaire, il a été constaté que près de 48,0 ± 2,0 % de carbone étaient présents dans les cellules N+, tandis que 46,0 ± 2,0 % étaient présents dans les cellules N−. La teneur totale en carbone par cellule était de 0,4 ± 0,1 ng cellule-1 dans la condition N- et de 0,3 ± 0,0 ng cellule-1 dans la condition N+. Dans l'ensemble, les résultats suggèrent que la disponibilité de l'azote affecte l'accumulation de paramylon et la composition de la matière particulaire dans les cellules.

Dans cette étude, nous avons observé un taux de croissance supérieur de 23% dans la condition N− par rapport à la condition N+, qui ne peut pas être expliqué uniquement par les différences de fixation du carbone. Les réponses cellulaires varient avec le temps. Il était clair d'après les résultats qu'au cours des trois premiers jours de l'expérience, les cellules dans les deux conditions se développaient activement dans des conditions suffisantes en N, avec des concentrations de biomasse initiales similaires dans tous les réservoirs. Par conséquent, aucune différence significative n'a été observée dans les tests G-DF1 et G-DF2. Cependant, le taux de croissance pour tous les jours (G-DF3) a montré un contraste marqué entre les conditions N+ et N− avec une valeur de p inférieure à 0,05, indiquant un taux de croissance plus élevé dans les conditions N−. La taille moyenne des cellules dans la condition N− était également plus petite que dans la condition N+, ce qui se reflétait dans les tests D-DF2 et D-DF3 avec une valeur de p inférieure à 0,05. La tendance de la taille des cellules est cohérente avec les rapports précédents dans d'autres genres d'algues Scenedesmus et Rhodomonas, ainsi que des espèces comme Ankistrodesmus falcatus et Stephanodiscus minululus19,35. Fait intéressant, l'analyse de corrélation a montré que la réduction de la taille des cellules se produisait dans les conditions N + et N- pendant de courtes périodes de culture, mais elle semblait être plus prononcée dans les conditions N-. De plus, lors de périodes de culture prolongées, la taille et le nombre de cellules peuvent être influencés par des facteurs environnementaux au-delà de la disponibilité de l'azote, tels que la température. Dans l'étude actuelle, il a été constaté que les basses températures environnementales diminuent le taux de croissance et augmentent le volume cellulaire dans les deux conditions. Nos résultats sont cohérents avec les études précédentes qui indiquent la préférence d'E. gracilis pour la croissance protoplasmique à basse température et la division cellulaire à haute température36. Cependant, l'impact de la température sur la taille des cellules dans des conditions N- semble être minime et n'a pas été signalé auparavant. E. gracilis en condition N− a initialement montré un nombre de cellules inférieur et un diamètre similaire par rapport à la condition N+, tandis qu'après quelques semaines, un nombre de cellules plus élevé avec un diamètre plus petit a été observé, suggérant qu'une culture prolongée en conditions N− semi-continues module la physiologie d'E. gracilis. Dans les conditions N−, E. gracilis a dû s'adapter à l'environnement dans lequel la disponibilité de l'azote varie considérablement en peu de temps. Les cellules se développent rapidement initialement en raison d'un apport suffisant en N pendant 4 jours avant une famine de N de 3 jours, mais ont ensuite subi des modifications biochimiques pour stocker de l'énergie29. Il semble qu'E. gracilis soit capable de s'acclimater au processus cyclique d'acquisition de N dans des conditions N−, ce qui entraîne un taux de croissance plus élevé par rapport à la condition N+. Puisque la culture a été menée dans un étang ouvert, les conditions environnementales dans les cultures N+ et N− étaient similaires, les différences observées dans la croissance et la biomasse étaient en grande partie dues à la disponibilité de l'azote.

Dans des conditions N−, une taille de cellule plus petite peut suggérer une teneur en protéines plus faible19, et le pool de carbone est dirigé vers la synthèse de glucides ou de lipides23,24,25. Dans notre étude, nous avons observé une teneur élevée en paramylon (> 40%) dans des conditions N−, indiquant que le carbone est fixé dans le paramylon pour la conservation de l'énergie, ce qui entraîne une augmentation de la densité cellulaire. D'autre part, E. gracilis dans des conditions N + utilise le carbone fixe pour générer de l'énergie pour la division cellulaire, ce qui entraîne un nombre élevé de cellules mais une faible densité cellulaire. Cela ressort des différences de nombre de cellules et de biomasse entre les deux conditions au cours des premières semaines. Cependant, au fil du temps, le nombre de cellules était similaire dans les deux conditions, tandis que la biomasse restait plus élevée dans les conditions N-. Cela soutient davantage l'idée de l'acclimatation d'E. gracilis, lui permettant de se développer tout en accumulant du paramylon en utilisant le carbone fixe.

De plus, les résultats actuels montrent que la teneur en carbone par cellule était presque 1,5 fois plus élevée en conditions N- (0,42 ng cellule-1) qu'en conditions N+ (0,27 ng cellule-1). L'augmentation observée de la teneur en carbone par cellule pourrait également être due à une fixation accrue du carbone par la photosynthèse. Il est intéressant de noter qu'il n'y avait pas de différences significatives dans la teneur totale en chlorophylle malgré la privation d'azote. Mais d'après le graphique et la couleur des cultures N− suggèrent une légère réduction de la teneur en chlorophylle. Habituellement, la teneur en chlorophylle diminue dans ces conditions en raison de la perte préférentielle de certaines protéines chloroplastiques et éventuellement en équilibrant le processus photosynthétique37. De plus, il n'y avait pas de différence significative dans le rendement quantique avant et après l'incubation dans l'obscurité, on peut donc en déduire que les cultures N+ et N− sont également efficaces pour convertir l'énergie lumineuse en énergie chimique pendant la photosynthèse. Cependant, les résultats indiquent que les cultures N− peuvent supporter un taux de croissance et une production de paramylon plus élevés, suggérant que l'appareil photosynthétique de ces cultures était plus efficace et adapté pour faire face à la privation de N. Il a été précédemment émis l'hypothèse que les microalgues dans des conditions de limitation de N, avec une pigmentation plus faible, ont une efficacité photosynthétique élevée38. Cela a également été observé dans les plants de tournesol où le rendement quantique maximal n'a pas été influencé par une carence en N39. De plus, il a été prouvé que plusieurs voies de fixation du C (C3, C4 ou CAM) coexistent dans certaines algues marines40,41. Parmi lesquelles, la voie CAM joue un rôle crucial dans le maintien de la photosynthèse des plantes en conditions de stress et peut fixer le carbone pendant la nuit. Il a déjà été rapporté que les métabolites liés à la voie CAM étaient stimulés par des contraintes chimiques chez E. gracilis, indiquant son existence. Par conséquent, il est possible que l'activation de la voie CAM sous une privation semi-continue prolongée de N puisse contribuer à une activité photosynthétique active et à une fixation accrue du C chez E. gracilis.

Des résultats similaires en termes de croissance et de rendement de produit ont été observés dans une étude récente sur un mutant de Scenedesmus obliquus (SO120G) dans des conditions N−33. Alors que la teneur en chlorophylle dans l'étude actuelle n'était pas supérieure à celle du témoin, contrairement au cas avec le SO120G33. Ces réponses dans le SO120G se sont révélées être le résultat de la régulation à la hausse des gènes liés au complexe cytochrome b6/f (Pet B) et au transporteur de transport d'électrons photosynthétique (Pet J). Ces protéines assurent la médiation du transfert d'électrons du photosystème II au photosystème I et du transport d'électrons cyclique, améliorant l'efficacité photosynthétique. Chez E. gracilis, petB a été identifié comme faisant partie du complexe d'opérons petB-atpB-atpE dans le génome du chloroplaste comme les plantes terrestres42. L'activation de ce gène induit également l'expression du complexe ATP-synthase, essentiel à la synthèse d'ATP pour la cellule et la formation de produits. Il est également possible que la légère réduction de la teneur en Chl ait amélioré l'efficacité de pénétration de la lumière dans la culture et, à son tour, la formation du produit. Au cours des premières heures de carence en éléments nutritifs, le taux de formation du produit sera rapidement induit, suivi d'une diminution progressive43. Cet excès de lumière pourrait fournir l'énergie nécessaire à la formation du produit dans des conditions de privation d'azote44.

Contrairement à une croissance élevée en condition N−, un taux de croissance plus faible en condition N+ est également un résultat important pour comprendre la productivité de la biomasse. De nombreuses espèces de microalgues préfèrent l'azote sous forme d'ammonium, et des concentrations élevées d'ammonium dans le milieu de croissance améliorent l'absorption des ions NH4+ par les algues. Cependant, cela entraîne également un flux excessif de NH4 qui peut entraver la formation d'ATP et la régulation de la photosynthèse45. Cela peut conduire à un empoisonnement à l'ammonium, où le taux de conversion de l'ammonium en acides aminés sera plus lent que son afflux dans les cellules, réduisant ainsi le taux de croissance dans des conditions N+46. De plus, cela s'accompagne d'une diminution du pH, ce qui réduit l'efficacité de la fixation du CO2 par les algues. Dans cette étude, le pH était constamment maintenu entre 2,3 et 2,5 dans les conditions N+ et N-, et les cellules semblaient présenter une croissance active, indiquant l'absence d'empoisonnement à l'ammonium.

Les résultats de cette étude suggèrent que cette méthode de culture peut améliorer le rendement d'E. gracilis. et est une considération importante pour la viabilité économique de la culture des algues. La méthode réduit également le coût des apports en éléments nutritifs. De plus, la culture d'E. gracilis utilisant cette technique en combinaison avec des déchets de nutriments industriels, des digestats anaérobies de déchets organiques et le CO2 d'échappement des centrales électriques pourrait promouvoir une économie circulaire et contribuer à un environnement propre et durable9,47. De plus, cette approche peut être appliquée à d'autres microalgues, fournissant une source durable de biocarburants et d'autres bioproduits.

Cependant, la culture en étang ouvert présente plusieurs limites9. Maintenir un système de culture stable toute l'année est un défi, car il dépend de conditions météorologiques favorables telles que des températures chaudes et un ensoleillement suffisant et est donc limité à des régions géographiques spécifiques. Dans cette étude, une corrélation a été observée entre les conditions de croissance, telles que l'intensité lumineuse, la température et la consommation d'azote avec le temps, indiquant les effets des variations saisonnières. Les systèmes de bassins ouverts sont également vulnérables à la contamination par d'autres micro-organismes tels que les bactéries et autres algues, nécessitant des contrôles de contamination fréquents. Dans cette étude, la contamination ne s'est pas avérée significative lorsque le pH était maintenu en dessous de 2,5. De plus, les températures élevées dans les étangs ouverts peuvent entraîner une perte d'eau due à l'évaporation, entraînant une baisse de la productivité. Par conséquent, une surveillance et un entretien réguliers des niveaux d'eau dans les étangs sont nécessaires pour assurer une productivité optimale. Par conséquent, malgré le potentiel de la culture en étang ouvert, il est important de tenir compte de ces limites lors de la conception d'un système de culture d'algues pour la production commerciale.

En conclusion, cette étude a démontré qu'E. gracilis possède un mécanisme d'adaptation distinctif dans des conditions N− prolongées qui n'avaient pas été observées auparavant. Les résultats ont montré une augmentation progressive du nombre de cellules, une taille de cellule plus petite par rapport aux conditions de contrôle et une activité photosynthétique non affectée. D'autres études omiques sont nécessaires pour comprendre les mécanismes de régulation qui contribuent à ces observations uniques. Les résultats de cette étude ont des implications prometteuses pour la production à l'échelle industrielle d'E. gracilis et de paramylon en utilisant uniquement la souche de type sauvage. La culture semi-continue en étang ouvert à faible teneur en nutriments peut être adoptée, ce qui réduirait les coûts d'exploitation tout en augmentant la biomasse et le rendement des produits.

E. gracilis maintenu à Euglena Co., Ltd. (Tokyo, Japon) a été utilisé pour l'expérience. Toutes les expériences, y compris la mise à l'échelle des semences, ont été menées en utilisant le milieu Cramer Myers (milieu CM)1,28 avec du sulfate d'ammonium, ((NH4)2SO4), comme source d'azote (N) à une concentration de 70 mg L-1. Initialement, des cultures de semences de 2 L ont été préparées à partir de la culture mère, puis étendues à 30 L en laboratoire. La température, l'aération et l'intensité lumineuse des cultures de graines ont été maintenues à 30 ° C, 0, 01 vv-1 min-1 (10% CO2) et 800 μmol m-2 s-1 (éclairées en continu par des lampes fluorescentes), respectivement. Cette culture a ensuite été mise à l'échelle dans des étangs ouverts commençant à 1 m2 et augmentant de 50 m2, 500 m2, et enfin à un étang de raceway de 1000 m2. Chaque étape de mise à l'échelle a pris environ 7 jours. Avant l'expérience principale, la culture en raceway de 1000 m2 a été maintenue en semi-continu pendant 4 mois avec addition hebdomadaire de milieu CM frais.

Cette étude a été menée entre juillet 2022 et octobre 2022, en utilisant six réservoirs de 1 m2 : R11, R12, R13, R14, R15 et R16. Les cultures d'algues ont été cultivées en semi-continu sur un cycle hebdomadaire, avec une phase expérimentale de 5 jours suivie d'une phase d'entretien de 2 jours pour permettre une croissance suffisante jusqu'au cycle suivant. Dans trois réservoirs (R11, R14 et R15), les cultures étaient dans des conditions de contrôle avec des niveaux d'azote (N +) suffisants, et les trois autres dans R12, R13 et R16 dans des conditions de privation d'azote (N–) (Fig. 1) . Le processus de culture par famine N impliquait de soumettre les cultures à des conditions N− du jour 3 au jour 5 chaque semaine, tandis que les jours restants étaient maintenus dans des conditions N+.

Au début de chaque expérience hebdomadaire (jour 1), la concentration initiale de la biomasse dans chaque étang de 1 m2 a été ajustée à environ 50 gm-2, suivie de l'ajout du milieu CM requis sans la source de N. Les bassins ont ensuite été remplis jusqu'à une hauteur de 200 mm du fond avec de l'eau du robinet (volume total de 170 L). Pour les bassins N+, du (NH4)2SO4 a été ajouté comme source de N à une concentration d'environ 65 mg L−1. Pour les bassins N−, la concentration initiale d'ammonium-N a été fixée entre 4 et 8 mg L−1 et maintenue au-dessus de 2 mg L−1 pendant les 2 premiers jours de chaque cycle. Après les deux premiers jours, le N de la culture a été complètement consommé par les cellules et atteint en dessous du niveau de détection (0 mg L-1). Les étangs ont ensuite été laissés sous condition N− pendant les 3 jours suivants. Au jour 5 après l'échantillonnage, 15–30 mg L−1 (NH4)2SO4 ont été ajoutés aux bassins de N− pour maintenir la concentration d'ammonium-N au-dessus de 2 mg L−1 pendant deux jours jusqu'au cycle suivant. Il est crucial de surveiller et de maintenir les niveaux de (NH4) 2SO4 jusqu'à l'étape de famine N afin d'empêcher les cellules de subir une famine d'azote avant le début de l'expérience. Les prévisions météorologiques (température, nébulosité et précipitations) ont été étroitement surveillées pour les jours suivants et la quantité requise de (NH4) 2SO4 a été ajoutée en conséquence pour parvenir à une famine d'azote au jour 3 dans les bassins d'azote. Le même cycle a été répété la semaine suivante. Ce cycle a été répété chaque semaine jusqu'à fin octobre 2022. De plus, le mélange de la culture a été maintenu en faisant tourner les deux roues à aubes commandées à 75 tr/min. Une aération avec 10 % de CO2 a été fournie à tous les bassins à un taux de 0,01 vv−1 min−1 et le pH a été maintenu entre 2 et 2,5.

Un échantillonnage quotidien a été effectué à 17h00 pour mesurer la biomasse (poids des cellules sèches), le nombre de cellules, la taille et la teneur en NH4-N dans tous les bassins. Chaque 2ème et dernier jour de l'expérience hebdomadaire, 1,5 L de culture ont été récoltés à 15h00 et lyophilisés pour faire des échantillons de poudre.

La physiologie cellulaire et la contamination ont été évaluées quotidiennement à l'aide d'un microscope vertical OLYMPUS CX-41. Le nombre et le volume des cellules ont été mesurés à l'aide du système Sysmex Particle counter CDA-1000 (Sysmex corp., Hyogo, Japon).

Des filtres en fibre de verre (diamètre 47 mm, taille des pores ADVANTEC, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japon) ont été séchés pendant 2 h (h) à 100 ° C dans un four et pesés après refroidissement. Un échantillon de dix millilitres a été filtré à travers un filtre puis rincé (OU lavé) trois fois avec 10 ml d'eau distillée (Dw). (Toutes les étapes de filtration ont été réalisées avec une légère aspiration sous vide.) Le filtre humide a été séché pendant 2 h à 100 °C avant la pesée. La productivité de la biomasse a été mesurée par le taux de croissance et le taux de croissance spécifique, qui ont été calculés comme suit ;

où DMi est le poids sec (OR masse) au jour ti et v représente la quantité d'échantillon (10 mL). Les valeurs des mesures en triple ont été moyennées.

La concentration de Paramylon a été déterminée selon Ogawa et al. 201517. Les observations ont été mesurées à l'aide d'un lecteur d'absorbance basé sur un réseau SH-1300Lab (Corona Electric Co., Ltd., Ibaraki, Japon).

Le flux quotidien de photons a été enregistré à l'aide d'un enregistreur de flux de photons (capteur Eko-photon ML-020P, EKO, Japon), et la température de l'eau dans les bassins a été enregistrée à l'aide d'un enregistreur de température (Thermo Recorder TR-52i, T&D Corporation, Japon).

L'extraction totale de la chlorophylle a été réalisée à partir de 1 ml de culot de culture d'E. gracilis en utilisant du méthanol à 100 % [Toyama et al., 2019]. Pour la mesure de l'absorbance, un spectrophotomètre UVmini-1240 (Shimadzu Co. Ltd., Kyoto, Japon) a été utilisé. La teneur totale en chlorophylle (Chl a + b, µg mL−1) a été calculée comme suit48 ;

où A665 et A650 représentent l'absorbance à la longueur d'onde de 665 nm et 650 nm, respectivement.

De plus, pour comprendre l'influence de la privation semi-continue de nutriments sur l'activité photosynthétique, nous avons mesuré le rendement quantique (Qy ou Fv/Fm). L'efficacité photosynthétique (Qy) a été mesurée à l'aide d'AquaPen E-AP 110-C (Environmental Measurement Japan, CO., LTD., Japon). Deux échantillons frais de 10 ml chacun ont été prélevés dans chaque étang. Un échantillon a été enveloppé de papier d'aluminium et maintenu dans l'obscurité pendant 1 h avant la mesure de Qy, tandis que l'autre a été mesuré immédiatement après l'échantillonnage. La teneur en Chl et l'efficacité photosynthétique ont été mesurées au cours des deux dernières semaines de toute l'expérience.

Les teneurs en carbone total (TC) et en azote total (TN) ont été analysées par Sumica Chemical Analysis services Ltd., Japon. Des échantillons séchés d'E. gracilis collectés le jour 5 (dernier jour de la condition N-) de trois expériences hebdomadaires consécutives (semaine 1 à 3) ont été utilisés pour la mesure. La moyenne de ces données a été considérée comme la teneur maximale en C et N disponible disponible dans les cellules à la fin de chaque cycle. Le NH4-N dans le milieu a été mesuré en utilisant le milieu acellulaire à partir de 1 ml de suspension cellulaire. L'échantillon a d'abord été centrifugé à 10 000 tr/min pendant 1,5 min à l'aide d'une mini centrifugeuse à grande vitesse (GUSTO® HIGH-SPEED MINI CENTRIFUGE, HEA10050, ILLINOIS, USA), et le surnageant obtenu a été utilisé pour mesurer la teneur en NH4-N à l'aide de Digital Pack Test Multi SP : DPM-MTSP (Kyoritsu Chemical-Check Lab. Corporation, Japon).

Une analyse statistique a été réalisée pour évaluer la différence entre les conditions N− et N+ à l'aide du logiciel R-studio version 4.2.1. Les données de taux de croissance (G) et de diamètre (D) ont été divisées en 3 groupes différents appelés trames de données (DF) : DF1, DF2 et DF3. DF1 représente toutes les données de la semaine à partir du jour 1 uniquement, DF2 représente les données des jours 3 à 5 et DF3 représente toutes les données sur 5 jours. Une ANOVA à une voie a été réalisée sur chacun des G-DF et D-DF, ainsi que sur la teneur en chlorophylle et Qy. Le niveau significatif pour tous les tests a été fixé à 0,05. Pour le taux de croissance, le jour 1 a été calculé comme la différence entre le jour 2 et le jour 1 selon l'équation en (1), et de même pour les jours 3 à 5. Pour le diamètre de la cellule, les jours représentent la chronologie réelle. De plus, une analyse de corrélation de Pearson pour examiner les corrélations entre le rayonnement solaire, la température et le temps (en jours et en semaines) avec des variables telles que la teneur en N dans les cellules, le diamètre des cellules N+ et le diamètre des cellules N− a également été réalisée.

Toutes les données sont fournies dans le manuscrit sous forme de figures, de tableaux et de données supplémentaires.

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Cette étude est basée sur les résultats obtenus à partir d'un projet commandé par la New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO), Govt. du Japon, Japon. Nous remercions Mieko Oue, Akiko Nishimura et Yui Yamamoto pour leur support technique. Nous remercions également Koji Yamada.

Algae Energy Technology Research Institute, 649-17 Nishiyama, Taki-cho, Taki-gun, Mie, 519-2171, Japon

Ranjith Kumar Bakku, Yoshimasa Yamamoto, Yu Inaba, Taro Hiranuma, Enrico Gianino, Lawi Amarianto, Waleed Mahrous et Hideyuki Suzuki

Euglena Co., Ltd., G-BASE Tamachi 2e et 3e étage, 5-29-11, Shiba, Minato-ku, Tokyo, 108-0014, Japon

Ranjith Kumar Bakku, Yoshimasa Yamamoto, Yu Inaba, Taro Hiranuma, Enrico Gianino, Lawi Amarianto, Waleed Mahrous, Hideyuki Suzuki et Kengo Suzuki

Microalgae Production Control Technology Laboratory, RIKEN 1-7-22, Suehiro, Tsurumi, Yokohama, Kanagawa, 230-0045, Japon

Kengo Suzuki

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RKB a réalisé les expériences, l'analyse des données et la rédaction du manuscrit. Y. Y a effectué une analyse paramylone. IY, TH, EG, LA & WM pris en charge dans la préparation des bassins, l'installation électrique, l'échantillonnage et l'entretien des bassins. HS, & KS ont conçu et conçu des expériences. Tous les auteurs ont également contribué à la rédaction et à la relecture du manuscrit.

Correspondance avec Ranjith Kumar Bakku ou Hideyuki Suzuki.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Bakku, RK, Yamamoto, Y., Inaba, Y. et al. Nouvelles connaissances sur la culture en raceway d'Euglena gracilis sous privation d'azote semi-continue à long terme. Sci Rep 13, 7123 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34164-1

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Reçu : 23 décembre 2022

Accepté : 25 avril 2023

Publié: 02 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34164-1

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