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Nov 05, 2023

Découplage des taux de respiration et de l'abondance dans le procaryoplancton marin

Nature tome 612, pages

Nature volume 612, pages 764–770 (2022)Citer cet article

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L'échange océan-atmosphère de CO2 dépend en grande partie de l'équilibre entre la photosynthèse microbienne marine et la respiration. Malgré une vaste diversité taxonomique et métabolique parmi les bactéries planctoniques marines et les archées (procaryoplancton)1,2,3, leur respiration est généralement mesurée en vrac et traitée comme une « boîte noire » dans les modèles biogéochimiques mondiaux4 ; cela limite la compréhension mécaniste du cycle global du carbone. Ici, en utilisant une technologie d'analyses phénotypiques intégrées et de séquençage génomique de cellules microbiennes individuelles, nous montrons que les taux de respiration spécifiques aux cellules diffèrent de plus de 1 000 × parmi les genres de procaryoplancton. La majorité de la respiration s'est avérée être effectuée par des membres minoritaires du procaryoplancton (y compris le groupe Roseobacter), alors que les cellules des lignées les plus répandues (y compris Pelagibacter et SAR86) avaient des taux de respiration extrêmement faibles. Le découplage des taux de respiration de l'abondance parmi les lignées, le nombre élevé de transcrits de protéorhodopsine dans les cellules Pelagibacter et SAR86 et la respiration élevée de SAR86 la nuit indiquent que la phototrophie à base de protéorhodopsine3,5,6,7 constitue probablement une source importante d'énergie pour le procaryoplancton et peut augmenter l'efficacité de la croissance. Ces résultats suggèrent que la dépendance du procaryoplancton à la respiration et à la reminéralisation du carbone organique dérivé du phytoplancton en CO2 pour ses besoins énergétiques et sa croissance peut être inférieure à ce que l'on suppose généralement et variable selon les lignées.

L'approche de la boîte noire de la respiration du procaryoplancton présente un contraste frappant avec les preuves accablantes de la diversité phylogénétique et génomique considérable du procaryoplancton1,2,3 et les grandes différences de taux de croissance et d'absorption de substrat organique entre les lignées, comme indiqué par l'hybridation in situ microautoradiographique par fluorescence (MAR -FISH)8, la spectrométrie de masse des ions secondaires à l'échelle nanométrique FISH (nanoSIMS)9 et le sondage des isotopes stables (SIP)10. Certains des processus métaboliques prédits par le génome, tels que la phototrophie à base de protéorhodopsine3,5,6, peuvent avoir un effet direct sur la respiration du procaryoplancton et la libération de CO2 dans l'atmosphère, mais leur importance globale reste mal limitée. Ici, nous avons développé une méthode pour les mesures intégrées du taux de respiration en oxygène in situ et le séquençage génomique de cellules microbiennes individuelles pour montrer que les taux de respiration diffèrent de plus de trois ordres de grandeur parmi les genres de procaryoplancton. Nos résultats fournissent des preuves de l'importance de la phototrophie de la protéorhodopsine en tant que source d'énergie complémentaire à la respiration dans les lignées prévalentes de procaryoplancton et de son impact potentiel sur le cycle global du carbone. Ces résultats démontrent la faisabilité de lier directement les génomes et les phénomes microbiens à la résolution unicellulaire et soulignent l'importance de briser la boîte noire du procaryoplancton marin en composants fonctionnellement plus significatifs dans les modèles d'écosystème.

RedoxSensor Green (RSG) a déjà été utilisé dans des études en laboratoire et environnementales de divers micro-organismes en tant que sonde de viabilité cellulaire spécifique à l'activité de l'oxydoréductase11. Pour évaluer la faisabilité de l'utilisation de RSG de manière quantitative, nous avons analysé la relation entre la consommation d'oxygène en vrac et la fluorescence RSG unicellulaire dans des cultures pures de bactéries aquatiques phylogénétiquement diverses (le flux de travail méthodologique est illustré dans Extended Data Fig. 1 et tableau supplémentaire 1). Les cellules en phase stationnaire variaient en intensité de fluorescence RSG dans toutes les cultures (données étendues Fig. 2a), indiquant une hétérogénéité physiologique cohérente avec les études précédentes12,13, mais étaient distinctes des témoins négatifs (données étendues Fig. 2b). La fluorescence moyenne par cellule était corrélée au taux moyen de consommation d'oxygène par cellule dans la plage analysée (environ 1 à 1 000 amol O2 par cellule par heure, R2 = 0, 86), sans preuve de biais taxonomiques (Fig. 1a). Cet étalonnage de culture a permis l'utilisation de l'intensité de fluorescence RSG comme indicateur du taux de respiration d'une cellule individuelle.

a, Comparaison de l'intensité de fluorescence RSG normalisée avec les taux de consommation d'O2 spécifiques aux cellules dans les cultures de laboratoire. Chaque point représente une expérience de culture (n = 50), avec les valeurs de fluorescence normalisées aux normes de perle de fluorescence utilisées pour intercalibrer l'instrument. Des détails expérimentaux supplémentaires sont fournis dans le tableau supplémentaire 1. b, Comparaison des taux de respiration du procaryoplancton marin en vrac déterminés à l'aide des méthodes Winkler et RSG spécifiques aux cellules (n = 12). Pour la méthode RSG, le taux de respiration moyen par cellule a été calculé à partir des taux de respiration par cellule, puis utilisé pour calculer la quantité totale d'O2 consommée avec le nombre de cellules marquées au RSG par ml. Dans les deux graphiques, la zone ombrée plus foncée représente l'intervalle de confiance à 95 %, et la zone ombrée plus claire est l'intervalle prédit à 95 %, autour de la droite de régression.

Pour valider l'utilisation du RSG dans la quantification de la respiration dans les études environnementales, nous avons effectué des mesures simultanées de sondage RSG et de respiration en vrac à cellule unique en utilisant la méthodologie Winkler traditionnelle sur des échantillons de procaryoplancton géographiquement diversifiés dans des conditions in situ. Les taux de consommation d'O2 spécifiques aux cellules ont été calculés à l'aide de l'étalonnage de la culture (Fig. 1a) et ont été utilisés pour estimer les taux de consommation en vrac. Les deux techniques ont produit des estimations similaires de la consommation d'O2 dans toute la plage analysée de 0,008 à 2,3 µmol O2 par l par h (Fig. 1b). Cela a fourni une preuve supplémentaire que le RSG peut être utilisé comme indicateur des taux de respiration microbienne en oxygène dans un contexte environnemental. Sur la base d'une variété d'échantillons témoins tués, le seuil de détection analytique spécifique à la cellule s'est avéré être d'environ 4 amol O2 par cellule par heure (données étendues Fig. 3a, b) dans les échantillons environnementaux. La plus faible abondance de cellules que nous avons pu quantifier à l'aide de notre analyse par cytométrie en flux était d'environ 106 cellules par litre (réf. 15). Cela se traduit par une limite de détection théorique des mesures de respiration de la communauté microbienne basée sur le RSG d'environ 4 pmol d'O2 par l par h, ce qui est d'environ quatre ordres de grandeur inférieur aux tests de consommation d'O2 standard utilisant Winkler ou la détection par capteur optode14. Ainsi, l'approche RSG peut permettre des mesures de la respiration microbienne dans des environnements à faible biomasse et/ou à faible activité, dans lesquels les méthodes actuelles manquent de sensibilité. De plus, le sondage RSG ne prend que quelques minutes, ce qui augmente la résolution temporelle de la mesure et réduit le risque d'effets de bouteille par rapport aux incubations généralement ≥24 h pour les mesures de Winkler4. Surtout, cette approche mesure uniquement la respiration à la résolution des cellules individuelles et de manière non destructive, ce qui offre des possibilités d'étudier la variabilité de la respiration intercellulaire et de la combiner avec d'autres analyses des mêmes cellules.

Pour comparer les taux de respiration parmi les lignées de procaryoplancton et relier ces mesures au contenu du génome et à la taille des cellules des lignées, nous avons effectué un sondage RSG et une génomique unicellulaire ultérieure sur six échantillons de procaryoplancton marin prélevés sur la côte du golfe du Maine (GoM ; 43,86 ° N , 69,58° O) sur une période de deux ans (tableau supplémentaire 2). Des génomes amplifiés simples (SAG) ont été générés et séquencés à l'aide de techniques décrites précédemment, avec l'utilisation supplémentaire de RSG comme source de fluorescence dans le tri cellulaire par cytométrie en flux, au cours duquel les propriétés optiques de chaque cellule ont été enregistrées. Par la suite, l'intensité de diffusion de la lumière à l'angle vers l'avant a été utilisée pour estimer le diamètre de chaque cellule16. La fluorescence RSG spécifique aux cellules dans trois de ces échantillons, collectés en octobre 2018, avril 2019 et juillet 2019, a été convertie en taux de respiration à l'aide de l'étalonnage de culture décrit ci-dessus. En raison de changements dans la configuration de l'instrument, les trois échantillons précédents, collectés en 2017, ont été analysés de manière similaire mais sans la conversion quantitative de la fluorescence RSG en taux de respiration.

Nous avons récupéré une fraction similaire de génomes de cellules individuelles qui ont été sondées avec RSG ou le colorant d'acide nucléique couramment utilisé SYTO-9, démontrant la compatibilité de RSG avec l'amplification et le séquençage d'ADN unicellulaire en aval (Extended Data Fig. 3c). Les estimations basées sur le RSG des taux de respiration globale avaient une plage de 0,35 à 0,78 µmol O2 par l par h, ce qui est cohérent avec les mesures précédentes dans le GoM17 et d'autres environnements côtiers18. Les taux de respiration estimés des cellules individuelles s'étendaient sur cinq ordres de grandeur, de la détection inférieure (<0,004 fmol O2 par cellule par h) à environ 145 fmol O2 par cellule par h (Fig. 2a, Données étendues Fig. 4 et Tableau supplémentaire 3 ). Bien qu'une variation substantielle des taux de respiration se soit produite même parmi les cellules avec des génomes presque identiques, les cellules avec une identité moyenne d'acides aminés prévue supérieure à environ 60% avaient des taux de respiration plus uniformes par rapport aux cellules avec une plus grande divergence du génome, correspondant approximativement à la frontière entre les genres dans l'art contemporain. taxonomie procaryote (Fig. 2b). Ainsi, pour simplifier notre ensemble de données d'une manière biologiquement significative, nous avons regroupé les SAG au niveau du genre.

a, La composition phylogénétique, les taux de respiration et les diamètres des cellules individuelles de procaryoplancton collectées en octobre 2018. L'arbre de vraisemblance maximale du gène de l'ARNr 16S qui était enraciné dans Archaea est montré. Les valeurs bootstrap supérieures à 0,75 sont indiquées par des cercles noirs. Les genres sont séparés par des nuances de gris et de blanc. Les noms des genres discutés dans cet article sont indiqués. Les entrées de référence des isolats cultivés sont indiquées par un astérisque rouge. b, La relation entre l'identité des acides aminés et le rapport de la consommation d'O2 dans les paires de cellules récupérées à partir du même échantillon. La ligne noire indique le ratio médian de consommation d'O2 à des intervalles de 1 % et la zone grisée est délimitée par le quantile de 10 % en dessous et le quantile de 90 % au-dessus. c, Abondance cellulaire spécifique au genre sur la base du recrutement de lecture métagénomique. d, taux de respiration par cellule spécifiques au genre. Les diagrammes en boîte et moustaches indiquent la médiane (ligne médiane), les premier et troisième quartiles (limites de la boîte) et 1,5 × l'intervalle interquartile (moustaches). Les points indiquent les valeurs aberrantes en dehors de l'intervalle interquartile de 1,5 ×. e, La fraction de respiration procaryoplancton réalisée par chaque genre. Inclus dans c–e sont les dix genres les plus abondants et les dix genres avec la plus grande contribution à la respiration de la communauté. Les lignes grises verticales séparent les genres. Les couleurs en c–e sont telles que définies en a. Notez que les estimations de respiration spécifiques au genre prennent en compte les cellules qui tombent en dessous de la limite de détection RSG, comme décrit dans les méthodes. Pour c–e, la date d'échantillonnage est indiquée en haut à gauche de c et le nombre de cellules triées et séquencées par jour était n = 282 (30 octobre 2018), n = 274 (2 avril 2019) et n = 277 (9 juillet 2019).

Nos résultats ont révélé des différences substantielles dans les taux de respiration spécifiques aux cellules et les contributions à la consommation d'oxygène du procaryoplancton entre les genres (Fig. 2c – e). À l'extrémité supérieure du spectre, les genres ASP10-02a (Gammaproteobacteria), LFER01 et Planktomarina (tous deux membres du clade Roseobacter, Rhodobacteraceae, Alphaproteobacteria) contenaient des cellules respirant plus de 1 fmol O2 par cellule et par heure. Planktomarina a contribué de 10 à 37% de la consommation totale d'O2 aux trois moments tout en ne comprenant que 1,2 à 2,5% des cellules. Les cellules avec des taux de respiration intermédiaires de 0, 01 à 1 fmol O2 par cellule et par heure étaient dominées par Amylibacter (clade Roseobacter), plusieurs genres de Bacteroidia, le genre Gammaproteobacteria Thioglobus et plusieurs genres moins abondants (Extended Data Fig. 5). À l'extrémité inférieure du spectre, 99 des 303 genres identifiés ne contenaient aucune cellule dépassant notre limite de détection d'environ 0,004 fmol O2 par cellule par heure. Notamment, trois des cinq genres les plus répandus ne contenaient aucune cellule respirant plus de 0,03 fmol O2 par cellule par heure à tout moment : le genre Alphaproteobacteria Pelagibacter et deux genres du groupe Gammaproteobacteria SAR86 (AAA076-P13 et D2472). Pelagibacter et SAR86 constituaient collectivement 22 à 24% de toutes les cellules à travers les moments, tout en ne représentant que 0,6 à 5,6% de la respiration totale du procaryoplancton. L'estimation basée sur le RSG de la consommation moyenne d'O2 par Pelagibacterin GoM (environ 5,0 amol O2 par cellule par h) était similaire aux mesures précédentes dans une culture en phase stationnaire (environ 1 à 10 amol O2 par cellule par h)19. De même, le clade Roseobacter et ASP10-02a seraient surreprésentés parmi les cellules de procaryoplancton les plus actives dans les efflorescences algales et les environnements côtiers20,21,22. Ainsi, nos résultats sont en accord général avec les études précédentes, ce qui suggère que les analyses unicellulaires basées sur le RSG offrent une évaluation réaliste des différences de taux de respiration entre les taxons de procaryoplancton.

Lors de l'examen des trois expériences dans lesquelles la respiration spécifique aux cellules a été quantifiée, les différences saisonnières les plus prononcées ont été observées dans le genre gammaprotéobactérien ASP10-02a et divers genres de Flavobacteriaceae (Bacteroidia) (Fig. 2c, d). Ces genres présentaient les taux de respiration et les abondances cellulaires spécifiques aux cellules les plus élevés en avril 2019. De même, les Flavobacteriaceae et ASP10-02a avaient une fluorescence RSG et une abondance relative de cellules élevées en avril par rapport aux mois d'août et de novembre, dans les expériences non calibrées de 2017 ( Données étendues Fig. 6). Bien que cette étude ait une résolution temporelle limitée, il convient de noter que les deux expériences d'avril ont eu lieu pendant ou peu de temps après la prolifération d'algues printanières du GoM (Extended DataFig. 3d). Nos résultats sont cohérents avec les rapports précédents sur les Flavobacteriaceae23,24,25,26 et ASP10-02a21 associées à la prolifération d'algues. Notamment, la plupart des autres genres de procaryoplancton n'avaient pas de différences prononcées dans les taux de respiration spécifiques aux cellules entre les dates d'échantillonnage, malgré les grandes différences saisonnières de température et de productivité primaire dans le GoM27.

Nous avons effectué des analyses génomiques et respiratoires unicellulaires similaires d'échantillons provenant d'emplacements offshore géographiquement diversifiés dans les océans Atlantique et Pacifique (tableau supplémentaire 2). En moyenne, les micro-organismes de ces environnements oligotrophes avaient des taux de respiration par cellule inférieurs à ceux du procaryoplancton du GoM. Semblable au GoM, bon nombre des lignées les plus abondantes, y compris Pelagibacter et SAR86, avaient des taux de respiration extrêmement faibles (<10 amol O2 par cellule par h), tandis que la majeure partie de la consommation d'O2 pouvait être attribuée à des genres à faible abondance (Extended Data Figs 7 et 8). Collectivement, ces résultats et ceux du GoM suggèrent un découplage général des taux de respiration et de l'abondance des cellules parmi les taxons de procaryoplancton marin.

À l'exception des cyanobactéries, l'hétérotrophie couplée à la respiration d'oxygène est généralement supposée être la source d'énergie prédominante pour le procaryoplancton océanique de surface. Ainsi, notre découverte selon laquelle certaines des lignées de procaryoplancton les plus abondantes, en particulier Pelagibacter et SAR86, ont des taux de respiration spécifiques aux cellules in situ extrêmement faibles est déconcertante. Cela soulève des questions sur la façon dont ces micro-organismes maintiennent la prédominance numérique et ne sont pas concurrencés par des genres avec des taux de respiration spécifiques aux cellules in situ environ 100 fois plus élevés, tels que Planktomarina et ASP10-02a, et comment ces résultats peuvent être réconciliés avec des rapports antérieurs relativement élevés. taux in situ de doublement cellulaire, de synthèse protéique et d'absorption de substrat par Pelagibacter28.

Notre découverte de taux de respiration constamment faibles parmi toutes les cellules Pelagibacter et SAR86 analysées à toutes les dates et tous les emplacements de collecte d'échantillons (Fig. 2 et Données étendues Figs. 4, 7, 8 et 10) contredit les hypothèses précédentes de croissance effrénée par certains écotypes de Pelagibacter qui sont adaptés aux conditions locales29. La petite taille des cellules peut fournir une explication partielle de leur respiration minimale. Les cellules des genres Pelagibacter, AAA076-P13 et D2472 avaient en moyenne un diamètre d'environ 0,3 µm, tandis que le diamètre de Planktomarina, Amylibacter, LFER01 et ASP10-02a était en moyenne de 0,5 à 0,8 µm (tableau supplémentaire 4). En supposant une forme de cellule similaire, une double différence de diamètre se traduit par une différence octuple de biovolume. Ceci est substantiel, mais pas suffisant pour expliquer les écarts beaucoup plus importants dans les taux de respiration spécifiques aux cellules. De plus, nous n'avons observé qu'une faible corrélation entre le volume d'une cellule et le taux de respiration (Fig. 3a). Au lieu de cela, les taux de respiration basés sur le RSG étaient plus fortement corrélés au temps de doublement minimal prédit par le génome30 (Fig. 3b), ce qui suggère que les taux de croissance de nombreux genres étaient proches de leur maximum théorique dans les échantillons GoM analysés. Fait intéressant, nous n'avons trouvé aucune corrélation entre la respiration et la fréquence des cellules contenant de l'ADN viral parmi les genres, ni de différences dans les taux de respiration SAR86 entre les dates avec une fraction élevée (octobre 2018) et faible (juillet 2019) de cellules contenant le virus (Extended Data Fig. 3e), qui plaide contre les interactions phage-hôte ayant un impact majeur sur les taux de respiration du procaryoplancton spécifiques aux cellules.

a, Taux moyen pondéré de consommation d'O2 par rapport au biovolume. b, taux moyen pondéré de consommation d'O2 par rapport au temps de doublement minimal. c, Biovolume par rapport au nombre de transcrits du gène ARNr 16S. d, taux moyen pondéré de consommation d'O2 par rapport au nombre de transcrits du gène ARNr 16S. e, taux moyen pondéré de consommation d'O2 par rapport au nombre de transcrits d'ARNm. Pour a–d, chaque point de données représente une valeur moyenne calculée pour chaque genre et échantillon de terrain. Les lignes pleines indiquent les régressions et les lignes pointillées indiquent les valeurs médianes. Notez que les taux de consommation d'O2 pondérés prennent en compte les cellules qui tombent en dessous de la limite de détection RSG, comme décrit dans les méthodes.

Pour obtenir des informations supplémentaires sur la physiologie du procaryoplancton du GoM, nous avons généré des ensembles de données métatranscriptomiques quantitatives31 à partir de quatre des échantillons analysés. Les lectures individuelles ont été annotées à l'aide des SAG du GoM comme base de données de référence3 et normalisées en transcriptions par cellule. Le nombre moyen global de transcrits de gènes d'ARNm et d'ARNr 16S par cellule était de 36 et 426, ce qui est similaire aux rapports antérieurs sur le procaryoplancton côtier32. Cependant, notre étude a montré que ces nombres variaient considérablement entre les genres de procaryoplancton, allant de 5 à 144 par cellule pour l'ARNm et de 48 à 2 480 par cellule pour l'ARNr. Nous avons observé une corrélation entre la taille des cellules et le nombre de copies du transcrit d'ARNr (Fig. 3c), mais il n'y avait aucune corrélation significative entre les taux de respiration spécifiques aux cellules et le nombre de molécules d'ARNr ou d'ARNm (Fig. 3d, e), qui sont parfois utilisés. comme substituts de l'activité métabolique33,34. De plus, les comptages par biovolume d'ARNr étaient relativement uniformes entre les genres et ne différaient que du triple entre Pelagibacter et Planktomarina. Cela suggère que le nombre total de molécules d'ARNm ribosomiques et totales sont de mauvais indicateurs de la respiration cellulaire et que les processus de production d'énergie autres que la respiration peuvent être importants pour le métabolisme du procaryoplancton GoM.

La phototrophie à base de protéorhodopsine est une source complémentaire de synthèse d'ATP35, dont le potentiel de codage est répandu dans le procaryoplancton marin3,5,6,7, y compris la plupart des genres GoM (tableau supplémentaire 4). Ainsi, certaines lignées de procaryoplancton peuvent être des mixotrophes qui reposent sur une combinaison de processus hétérotrophes et phototrophes comme sources d'énergie. Une étude récente de la distribution des pigments dans la mer Méditerranée a indiqué que la protéorhodopsine capte une quantité d'énergie solaire similaire à la chlorophylle a, ce qui peut être suffisant pour maintenir le métabolisme de base d'une cellule procaryoplancton moyenne36. Bien qu'il soit bien connu que Pelagibacter et d'autres groupes prédominants de procaryoplancton de surface océanique consomment des composés organiques simples20,28,37, l'accès à l'ATP dérivé de la protéorhodopsine peut augmenter l'utilisation de ces molécules dans la biosynthèse par opposition à la respiration, augmentant ainsi l'efficacité de la croissance19,38 ,39. Cependant, il manque des preuves directes de l'importance de la protéorhodopsine dans l'énergétique cellulaire du procaryoplancton in situ et dans les processus biogéochimiques de l'océan5,6. Ici, nous avons constaté que le nombre de transcrits de protéorhodopsine par cellule était parmi les plus élevés chez les taxons présentant certains des taux de respiration détectables les plus bas, notamment Pelagibacter et SAR86, malgré la petite taille de leurs cellules (Fig. 4a). Compte tenu de l'extrême rationalisation des génomes et du métabolisme de Pelagibacter et de SAR86, l'abondance de transcrits de protéorhodopsine constitue une forte indication de l'importance de la phototrophie pour ces lignées prédominantes de procaryoplancton.

a, La relation entre les taux de respiration spécifiques aux cellules et le transcrit de la protéorhodopsine compte parmi les genres. Chaque point de données représente un genre et un seul échantillon de terrain. Les couleurs et les formes sont telles que définies à la Fig. 3. b, Schéma des rôles complémentaires de la respiration et de la phototrophie de la protéorhodopsine dans la génération du gradient de protons et de l'ATP dans le procaryoplancton. c,d, Taille des cellules, taux de respiration et affiliations taxonomiques des cellules individuelles de procaryoplancton collectées au GoM en août 2021 la nuit (c) et pendant la journée (d). Notez que les estimations de respiration spécifiques au genre prennent en compte les cellules qui tombent en dessous de la limite de détection RSG, comme décrit dans les méthodes.

Des études antérieures ont démontré un métabolisme différentiel du procaryoplancton entre le jour et la nuit, y compris un cycle diurne d'expression génique pour les transporteurs40 et les protéorhodopsines41. Toutes les expériences RSG décrites ci-dessus ont été réalisées en milieu de matinée, lorsque le nombre de transcrits de protéorhodopsine peut être le plus élevé41. Pour examiner l'impact potentiel de la phototrophie de la protéorhodopsine sur les taux de respiration, nous avons mené des expériences supplémentaires de sondage RSG et de génomique unicellulaire sur le procaryoplancton du GoM pendant le jour et la nuit en août 2021. Nous avons émis l'hypothèse que les hétérotrophes obligatoires augmentent leur taux de respiration pendant la journée, lorsque les algues la photosynthèse augmente la disponibilité de substrats organiques labiles. En revanche, on peut s'attendre à ce que les phototrophes procaryotes non cyanobactériens respirent davantage la nuit pour compenser l'absence de la pompe à protons pilotée par la protéorhodopsine (Fig. 4b). Conformément au premier scénario, le genre UBA10364 (Bacteroidota, Flavobacteriales) présentait des taux de respiration plus élevés pendant la journée que pendant la nuit (Fig. 4c, d, Extended Data Figs. 9 et 10). En revanche, les taux de respiration de AA076-P13 (SAR86) étaient six fois plus élevés (52 contre 8 amol O2 par cellule par h) la nuit par rapport au jour (test U de Mann-Whitney, P < 0,05 ; Données étendues Figs. 9 et 10), suggérant un effet potentiel de la phototrophie sur le métabolisme énergétique de ce genre. Il a déjà été démontré que les lignées SAR86 possèdent un ensemble diversifié de gènes de protéorhodopsine42,43, qu'elles peuvent utiliser pour compléter l'énergie produite par la respiration. La réduction diurne de la respiration AA076-P13 de 44 amol O2 par cellule par heure implique qu'une quantité comparable d'ATP peut avoir été générée en utilisant le gradient de protons piloté par la protéorhodopsine. Cependant, la respiration de Pelagibacter était similaire le jour et la nuit, à environ 5 amol O2 par cellule et par heure. Plusieurs facteurs peuvent avoir masqué le plein impact de la phototrophie de la protéorhodopsine sur les sources d'énergie du procaryoplancton dans notre expérience, notamment (1) la stimulation de la respiration par les produits de la photosynthèse pendant la journée ; (2) une capacité limitée de certains genres à réguler leur métabolisme, dont Pelagibacter37 ; (3) efficacité de croissance variable; et (4) une puissance statistique insuffisante en raison de la petite échelle de cette expérience. En faisant l'hypothèse spéculative que l'impact moyen à l'échelle de la communauté des pompes à protons pilotées par la protéorhodopsine équivaut à 44 amol O2 par cellule par heure pendant 12 heures par jour, nous pouvons estimer que le procaryoplancton du GoM utilise des protéorhodopsines pour générer l'ATP équivalent à celui généré à partir de 0,5 µmol O2 par l et par jour, soit un ordre de grandeur de moins que la respiration totale du procaryoplancton. L'importance de la phototrophie de la protéorhodopsine devrait être beaucoup plus grande dans les environnements oligotrophes offshore38, dans lesquels des taux de respiration inférieurs à 10 amol O2 par cellule et par heure sont typiques de la plupart des cellules de procaryoplancton (Extended Data Figs. 7 et 8) et de la protéorhodopsine peut absorber une quantité de lumière solaire comparable à la chlorophylle a36. Dans les régions productives, l'accès relativement constant à l'ATP dérivé de la protéorhodopsine peut atténuer l'impact des différences saisonnières de productivité du phytoplancton sur le procaryoplancton, contribuant ainsi à expliquer la saisonnalité limitée de la composition du procaryoplancton du GoM (Fig. 2c – e et Extended Data Fig. 4).

Des analyses intégrées du génome et du phénotype de cellules individuelles non cultivées ont révélé que les taux de respiration spécifiques aux cellules diffèrent de plus de 1 000 × parmi les genres de procaryoplancton marin. Nous avons constaté que, bien que la majorité de la respiration soit effectuée par des lignées relativement rares, les taxons de procaryoplancton les plus abondants ont des taux de respiration extrêmement faibles, remettant en question la source de leur avantage concurrentiel. Le découplage des taux de respiration et de l'abondance de la lignée, le nombre élevé de transcrits de protéorhodopsine dans les cellules à faible respiration et la respiration élevée de certains des taxons à faible respiration la nuit indiquent collectivement que la phototrophie à base de protéorhodopsine peut augmenter l'efficacité de la croissance et la productivité du prédominant. groupes de procaryoplancton, soit en fournissant de l'énergie pour l'absorption de nutriments, soit en favorisant la biosynthèse de biomolécules, entraînant un impact ultérieur sur les flux de carbone et d'énergie à la surface de l'océan.

Selon le fabricant (Thermo Fisher Scientific), les oxydoréductases convertissent le RSG en un produit fluorescent vert à l'intérieur des cellules vivantes, qui peut être quantifié par microscopie ou cytométrie en flux. Par rapport à une sonde de tétrazolium CTC44 fonctionnellement similaire et précédemment utilisée, RSG a des propriétés spectrales de fluorescence supérieures, un temps d'incubation plus court et aucun effet toxique connu11. Le manuel du kit BacLight RedoxSensor Green Vitality (Thermo Fisher Scientific) recommande une incubation de 10 minutes avec RSG avant de procéder aux analyses cellulaires. Pour tester l'impact de la durée d'incubation sur l'abondance et l'intensité de la fluorescence des cellules de procaryoplancton marin, nous avons effectué un test sur l'eau de mer prélevée sur la côte GoM (43,8609° N, 69,5782° W) le 11 août 2016. Deux échantillons d'eau de mer de surface répétés ont été prélevés dans tubes stériles en polypropylène de 50 ml et transportés au laboratoire à température in situ pour un traitement ultérieur. Ces échantillons ont été modifiés avec la concentration de RSG recommandée par le fabricant (concentration finale de 1 µM) et incubés à température in situ dans l'obscurité pendant une durée variable avant d'être analysés à l'aide du cytomètre en flux BD Influx Mariner (Becton Dickinson, anciennement Cytopeia) équipé avec un laser de 488 nm pour l'excitation et un orifice de buse de 70 μm. Les cellules RSG-positives ont été contrôlées sur la base de la fluorescence verte des particules (passe-bande 531/40), de la diffusion vers l'avant et du rapport de fluorescence verte par rapport à la fluorescence rouge (passe-bande 692/40 ; pour une meilleure discrimination des cellules des particules détritiques). Nous avons constaté que l'abondance et l'intensité de fluorescence des cellules RSG-positives atteignaient leurs valeurs maximales et restaient stables après 30 à 70 minutes d'incubation (Extended Data Fig. 3f). Sur la base de ces résultats, les incubations RSG ultérieures ont été fixées à 30 min.

Des isolats d'espèces phénotypiquement distinctes, Shewanella loihica45, Roseobacter denitrificans46, Pseudomonas stutzeri47, Ruegeria pomeroyi48 et Vibrio alginolyticus49, ont été acquis auprès du National Center for Marine Algae and Microbiota. Des isolats de Rhodoluna lacicola50 et d'Oligotropha carboxidovorans51 ont été obtenus auprès de la Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires. Les cultures ont été cultivées dans des milieux spécifiques à différentes températures et concentrations de nutriments (les recettes moyennes et les conditions de croissance sont fournies dans le tableau supplémentaire 1) dans des flacons de sérum en verre de 70 ml scellés avec des bouchons en caoutchouc butyle avec de l'air atmosphérique dans l'espace de tête (concentration initiale d'O2 21%) sur une table d'agitation rotative pour faciliter l'échange complet de gaz entre le milieu de culture et l'espace de tête du récipient. Une approche d'espace de tête a été utilisée en raison de la nécessité de retirer de petits volumes de fluides à des moments discrets.

La concentration en oxygène dans tous les récipients de culture a été mesurée à l'aide du compteur optique Firesting-O2 conformément aux instructions du fabricant (technologie de capteur PyroScience). Pour chaque bouteille de sérum, la sonde optode a été insérée dans l'espace de tête avec la sonde de normalisation de température également insérée dans un espace de tête de bouteille différent (avec de l'eau de mer en phase liquide) maintenue à la même température que la culture en cours d'analyse. La concentration en oxygène a été mesurée dans l'espace de tête et convertie en concentration d'oxygène dissous dans le milieu de culture, en supposant un équilibrage gazeux complet entre le milieu de culture et l'espace de tête de culture (toutes les cultures étant conservées sur une table d'agitation rotative) et en tenant compte de la température, de l'espace de tête pression et salinité du milieu de culture52. Cette conversion a été possible grâce à la méthode optode Firesting-O2 de mesure directe de l'O2 à la pointe de la sonde optode (c'est-à-dire qu'il n'y a pas de diffusion ou de consommation d'O2 via cette méthode). Après avoir mesuré l'O2 dans l'espace de tête, la concentration présente dans le milieu de culture a été calculée à l'aide de la technique d'équilibrage de l'espace de tête et calculée53 à l'aide des coefficients de Bunsen54,55 pour l'O2, qui prend en compte la température et la salinité à pression atmosphérique constante au niveau de la mer. Les concentrations d'O2 dans le milieu de culture ont été mesurées toutes les quelques heures sur la base du temps de doublement estimé de chaque type de culture. Les mesures de la concentration d'O2 pour chaque culture couvraient l'inoculation initiale à travers la phase logarithmique de croissance jusqu'à ce que la phase stationnaire soit atteinte. Les changements opérationnels dans l'abondance des cellules microbiennes ont été déterminés sur la base de mesures de densité optique à une longueur d'onde de 600 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. Une culture a été déterminée comme étant en phase stationnaire une fois que la concentration d'O2 ne diminuait plus de façon exponentielle et lorsque l'abondance des cellules avait cessé d'augmenter de façon exponentielle. Pendant la phase stationnaire, les taux de respiration d'O2 ont été calculés en tant que différences normalisées dans le temps de la concentration d'O2 entre les mesures. Pour estimer les taux de respiration d'O2 par cellule moyenne, l'abondance des cellules microbiennes a été déterminée par analyse par cytométrie en flux de sous-échantillons du matériel de culture prélevés en même temps que les concentrations d'O2 ont été mesurées, comme décrit ci-dessous.

Après que les cultures aient atteint la phase stationnaire, des sous-échantillons de 1 ml ont été prélevés à l'aide d'une aiguille et d'une seringue stériles, transférés dans un cryotube de 2 ml et modifiés avec 1 ul de solution mère de RSG. Après un mélange doux, les cryovials ont été incubés pendant 30 min à la même température que leurs cultures sources. Les cryovials ont ensuite été modifiés avec du glycérol à 5% et du tampon Tris-EDTA 1 × pH 8 (concentrations finales), congelés rapidement dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation en aval dans l'analyse par cytométrie en flux. Après le prélèvement d'échantillons incubés au RSG et alors que la culture était encore en phase stationnaire, des témoins tués pour chaque type de culture ont été préparés en autoclavant 10 ml de culture et de milieu pendant 30 min à 121 ° C. Des échantillons de milieu non inoculé et de témoins tués ont également été prélevés pour être utilisés dans la détermination des portes appropriées pour l'analyse par cytométrie en flux en aval.

Après décongélation, les échantillons cryoconservés ont été analysés à l'aide du cytomètre en flux ZE5 Cell Analyzer (Bio-Rad). Les échantillons ont été analysés avec une excitation bleue (488 nm) et l'instrument a été déclenché à la fois sur la diffusion vers l'avant et la fluorescence verte à l'aide d'un filtre passe-bande 525/35 nm. La porte d'analyse a été définie sur la base de la fluorescence verte des particules (RSG) et de la diffusion latérale à angle droit. Les portes d'analyse ont été réglées pour éliminer les zones qui ne contenaient que du bruit de particules non cellulaires à partir de blancs de milieux non inoculés, et également en éliminant les zones qui contenaient des cellules mortes (tuées par autoclavage). Pour tous les échantillons de culture, une zone de cellules en croissance a été clairement définie (Extended Data Fig. 2b). L'abondance des cellules et la fluorescence verte ont été analysées dans FlowJo v.10.6.2 (Becton Dickinson).

Pour tenir compte de la dérive quotidienne et des différences entre le cytomètre en flux de l'analyseur de cellules ZE5 (Bio-Rad) et les instruments et paramètres de cytométrie en flux du cytomètre en flux BD Influx Mariner (Becton Dickinson, anciennement Cytopeia), une procédure a été développée pour normaliser le vert des cellules fluorescence en utilisant l'un des deux kits standard de taille de particules fluorescentes : NFPPS-52-4K ou RCP-30-5A (Spherotech). Ces billes ont été analysées par cytométrie en flux chaque jour lorsque les cellules marquées au RSG ont été analysées, en utilisant le même instrument et les mêmes paramètres. Pour chaque bille, la moyenne géométrique de la fluorescence 525/35 a été calculée à l'aide de FlowJo. Pour le kit de billes NFPPS-52-4K, la bille la moins fluorescente s'est vu attribuer une valeur de fluorescence normalisée égale à 1 et les valeurs de fluorescence normalisées des autres billes (tableau supplémentaire 5) ont été calculées comme le rapport moyen de leur fluorescence par rapport à la fluorescence de la bille la moins fluorescente. Les moyennes de ces ratios ont été estimées à partir de l'application de cette technique sur plusieurs jours.

Pour chaque jour d'analyse des échantillons de terrain et de culture, une régression linéaire a été effectuée pour établir la relation entre la fluorescence mesurée des billes et leurs valeurs de fluorescence normalisées. Ensuite, la fluorescence normalisée de chaque cellule a été estimée comme suit :

où x est la fluorescence mesurée d'une cellule, m est la pente déterminée expérimentalement de la régression linéaire de la perle à partir du jour de l'analyse cellulaire et b est l'interception déterminée expérimentalement de la régression linéaire de la perle à partir du jour de l'analyse cellulaire.

Pour interétalonner les deux ensembles de billes, elles ont été co-analysées par cytométrie en flux sur plusieurs jours sur le cytomètre en flux BD Influx Mariner et la fluorescence normalisée de la moyenne géométrique de chaque bille RCP-30-5A a été calculée à l'aide de l'équation de régression linéaire décrite ci-dessus. Une valeur de fluorescence normalisée normalisée a été calculée en faisant la moyenne géométrique des billes RCP-30-5A de plusieurs jours (tableau supplémentaire 5 (colonne RCP-30-5A)). La fluorescence normalisée normalisée des billes RCP-30-5A a été utilisée pour effectuer une analyse de régression linéaire afin d'établir la relation entre la fluorescence mesurée des billes et leur fluorescence normalisée (voir ci-dessus) les jours où les billes NFPPS-52-4K n'étaient pas disponible.

Par la suite, nous avons corrélé la fluorescence normalisée des cultures microbiennes à leur taux de respiration moyen (Fig. 1a), ce qui a donné la relation exponentielle suivante :

où la respiration cellulaire est l'estimation de la respiration spécifique à la cellule en fmol O2 par cellule par heure et la fluorescence normalisée est la fluorescence RSG normalisée de la cellule (voir ci-dessus). Cette équation a été transformée pour faciliter l'interprétation sur la figure 1a.

Pour valider l'utilisation du RSG dans la quantification de la respiration, nous avons effectué des mesures simultanées de sondage RSG et de respiration en vrac à l'aide de la méthodologie Winkler traditionnelle14 sur des échantillons de procaryoplancton côtiers et océaniques géographiquement diversifiés dans des conditions in situ (tableau supplémentaire 2). Pour les échantillons du GoM, l'eau de mer a été collectée à une profondeur de 1 m à l'aide d'une bouteille Niskin au même endroit que les échantillons RSG décrits ci-dessus, à l'exception d'un échantillon (rivière Damariscotta), dont l'emplacement est indiqué dans le tableau supplémentaire 2. L'eau de mer a été collecté, passé à travers un filtre à mailles de 40 µm et utilisé pour remplir huit bouteilles de demande biologique en oxygène (DBO) sans espace de tête. Chaque flacon a été survolé d'au moins 3 fois son volume pour éviter les bulles d'air et pour omettre tout échange gazeux supplémentaire que l'eau aurait eu avec l'atmosphère lors du transfert dans la cuve. Quatre de ces flacons ont été immédiatement fixés56, tandis que les quatre flacons restants ont été incubés à température in situ dans l'obscurité pendant 24 h avant la fixation56. La concentration en oxygène dans toutes les bouteilles a été analysée à l'aide d'un titrateur ampérométrique56.

Les échantillons en haute mer ont été prélevés directement des bouteilles Niskin dans des flacons DBO, tandis que les échantillons côtiers de la mer Méditerranée ont été prélevés avec des seaux sur le rivage et transférés dans des bonbonnes en polycarbonate nettoyées à l'acide. Une fois au laboratoire, l'eau côtière de la mer Méditerranée a été filtrée à travers des filtres en polycarbonate de 0,8 µm et transférée dans des flacons DBO. Chaque flacon a été survolé d'au moins trois fois son volume. Les trois flacons BOD répliqués ont été fixés immédiatement et trois autres flacons ont été incubés dans l'obscurité à température in situ pendant 24 h. Après fixation avec les produits chimiques de Winkler, les échantillons ont été mesurés par la méthode potentiométrique56 (côte méditerranéenne et Atlantique nord) ou spectrophotométrie57 (Atlantique sud et équatorial). Les taux de respiration du procaryoplancton basés sur Winkler ont été estimés comme la différence de concentration en oxygène dissous entre les échantillons initiaux et finaux.

Immédiatement après la collecte de l'échantillon de terrain, les sous-échantillons ont été incubés avec du RSG à température in situ dans l'obscurité pendant 30 min, puis stockés à -80 ° C jusqu'aux analyses de cytométrie en flux et aux estimations des taux de respiration spécifiques aux cellules, comme décrit ci-dessus. Les taux de respiration en vrac basés sur le RSG ont été obtenus en multipliant les taux de respiration moyens spécifiques aux cellules (décrits ci-dessus) par l'abondance de cellules respiratoires dans chaque échantillon.

Pour l'étude principale, des échantillons du GoM ont été prélevés sur le quai du Bigelow Laboratory for Ocean Sciences sur la rive d'East Boothbay à l'embouchure de la rivière Damariscotta (43,8609° N, 69,5782° W) pendant six jours d'avril 2017 à juillet. 2019 (tableau supplémentaire 2). Des échantillons d'eau ont été prélevés à une profondeur de 1 m avec une bouteille Niskin de 5 l, passés à travers un filtre à mailles de 50 µm, transférés dans des bouteilles en polycarbonate lavées à l'acide, transportés au laboratoire à température in situ et traités immédiatement. Des échantillons en haute mer ont été prélevés avec des bouteilles Niskin de 12 l attachées à une rosette CTD et transférées dans des bouteilles en polycarbonate lavées à l'acide. Par la suite, des sous-échantillons d'eau de mer en double de 1 ml ont été transférés dans des cryotubes, modifiés avec 1 µl de RSG (concentration finale de 1 µM), incubés dans l'obscurité à température in situ pendant 30 min, modifiés avec 5 % de glycérol et 1 tampon TRIS-EDTA pH 8. (concentrations finales), surgelées dans du N2 liquide et conservées à -80 °C. Dans tous les cas, des sous-échantillons supplémentaires d'eau de mer de 1 ml ont été modifiés avec 5% de glycérol et un tampon TRIS-EDTA 1 × pH 8 (concentrations finales), congelés dans du N2 liquide et stockés à -80 ° C sans ajout de RSG.

Pour comparer les conditions de jour et de nuit, des échantillons d'eau de mer supplémentaires du GoM ont été prélevés sur le quai du laboratoire Bigelow selon les mêmes procédures que celles décrites ci-dessus les 24 (14h00 HNE) et 25 (02h00 HNE) août 2021. Triple aliquotes d'échantillons de 1 ml ont été marqués avec du RSG et cryoconservés comme décrit ci-dessus.

Pour le tri des cellules respiratoires, nous avons utilisé des échantillons marqués au RSG sur le terrain, comme décrit ci-dessus. Pour le tri non spécifique des cellules procaryoplancton, les échantillons d'eau de mer cryoconservés et décongelés ont été incubés avec le colorant d'acide nucléique SYTO 9 (concentration finale 5 µM ; Thermo Fisher Scientific) sur de la glace pendant 10 à 60 min. L'analyse et le tri par cytométrie en flux ont été effectués à l'aide d'un cytomètre en flux BD InFlux Mariner équipé d'un laser à 488 nm pour l'excitation et d'un orifice de buse de 70 μm (Becton Dickinson, anciennement Cytopeia). Le cytomètre a été déclenché sur diffusion vers l'avant dans la plupart des cas et sur fluorescence verte en août 2021. Le mode «single-1 drop» a été utilisé pour une pureté de tri maximale. La porte de tri a été définie en fonction de la fluorescence verte des particules (proxy de la teneur en acide nucléique ou du taux de respiration), de la diffusion vers l'avant (proxy du diamètre cellulaire) et du rapport de fluorescence verte par rapport à la fluorescence rouge (pour une meilleure discrimination des cellules des particules détritiques). Les cellules ont été déposées dans des microplaques à 384 puits contenant 600 nl par puits de tampon TE 1 × et stockées à -80 ° C jusqu'à un traitement ultérieur. Sur les 384 puits, 317 puits étaient dédiés aux cellules individuelles, 64 puits ont été utilisés comme témoins négatifs (pas de dépôt de gouttelettes) et 3 puits ont reçu 10 cellules chacun pour servir de témoins positifs. La précision du dépôt de gouttelettes dans les puits de la microplaque a été confirmée plusieurs fois au cours de chaque journée de tri en triant les particules fluorescentes SPHERO Rainbow de 3,46 µm de diamètre (Spherotech) et en examinant leur présence au fond de chaque puits à l'aide de la microscopie. Dans ces examens, moins de 2 % des puits ne contenaient pas de billes et < 0,4 % des puits contenaient plus d'une bille.

Les données de tri d'index ont été collectées à l'aide du logiciel BD Sortware. Les cultures de laboratoire suivantes ont été utilisées dans le développement d'une courbe d'étalonnage équivalente de diamètre cellulaire : Prochlorococcus marinus CCMP 2389 ; Microbacterium sp.; Pelagibacter ubique HTCC1062; et Synechococcus CCMP 2515. Les diamètres cellulaires moyens de ces cultures ont été déterminés à l'aide du compteur Multisizer 4e Coulter (Beckman Coulter). La dispersion vers l'avant moyenne de chacune des quatre cultures a été déterminée en utilisant les mêmes paramètres de cytométrie en flux utilisés lors du tri des échantillons environnementaux, répétés chaque jour du tri unicellulaire. Nous avons observé une forte corrélation entre les diamètres cellulaires et la diffusion vers l'avant (FSC) parmi ces cultures16. Profitant de cette corrélation, le diamètre estimé des cellules environnementales triées (diamètre, en µm) a été estimé à partir d'un modèle de régression log-linéaire :

où a et b sont des coefficients de régression obtenus empiriquement pour chaque jour de tri16, et FSC est la diffusion vers l'avant mesurée. Ce calcul a été répété pour toutes les sessions de tri de cellules de cytométrie en flux. Le volume cellulaire proxy a été calculé en supposant une forme sphérique pour toutes les lignées.

Avant l'amplification de l'ADN génomique, les cellules ont été lysées et leur ADN a été dénaturé par deux cycles de congélation-décongélation et l'ajout de 700 nl d'un tampon de lyse composé de 0,4 M KOH, 10 mM EDTA et 100 mM dithiothréitol, et une incubation ultérieure de 10 min à 20 °C. La lyse a été terminée par l'ajout de 700 nl de Tris-HCl 1 M, pH 4. L'amplification du génome entier à cellule unique a été réalisée à l'aide de WGA-X16. En bref, les 10 µl de réactions WGA-X contenaient des concentrations finales de 0,2 U µl−1 Equiphi29 polymérase (Thermo Fisher Scientific), 1 × tampon de réaction Equiphi29 (Thermo Fisher Scientific), 0,4 µM chaque dNTP (New England BioLabs), 10 µM dithiothréitol (Thermo Fisher Scientific), heptamères aléatoires 40 µM avec deux liaisons nucléotidiques phosphorothioates 3′-terminales (Integrated DNA Technologies) et 1 µM SYTO 9 (Thermo Fisher Scientific). Ces réactions ont été réalisées à 45 °C pendant 12 à 16 h, puis inactivées par une incubation de 15 min à 75 °C. Pour éviter que les réactions WGA-X ne soient contaminées par de l'ADN non cible, tous les réactifs de lyse cellulaire et d'amplification d'ADN ont été traités à la lumière ultraviolette dans un système Stratalinker (Stratagene)58. Une optimisation empirique de l'exposition aux ultraviolets a été effectuée pour déterminer la durée d'exposition aux ultraviolets nécessaire pour réticuler tous les contaminants détectables sans inactiver la réaction. Le tri cellulaire, la lyse et la configuration WGA-X ont été effectués dans un environnement filtré HEPA conforme aux spécifications de salle blanche de classe 1000. Avant le tri cellulaire, l'instrument, les réactifs et l'espace de travail ont été décontaminés pour l'ADN en utilisant une irradiation ultraviolette et une solution d'hypochlorite de sodium59. Afin de réduire davantage le risque de contamination par l'ADN et d'améliorer la précision et le débit, des manipulateurs de liquides robotiques Bravo (Agilent Technologies) et Freedom Evo (Tecan) ont été utilisés pour toutes les manipulations de liquides dans des plaques à 384 puits.

Des bibliothèques pour le séquençage génomique SAG ont été créées avec les réactifs Nextera XT (Illumina) conformément aux instructions du fabricant, à l'exception des étapes de purification, qui ont été effectuées à l'aide de kits de nettoyage de colonne (QIAGEN) et de la sélection de la taille de la bibliothèque, qui a été effectuée avec BluePippin (Sage Science ) avec une taille cible de 500 ± 50 pb. Les mesures de concentration d'ADN ont été effectuées à l'aide des kits de test d'ADNdb Quant-iT (Thermo Fisher Scientific) conformément aux instructions du fabricant. Les bibliothèques ont été séquencées soit avec le système NextSeq 500 (Illumina) en mode 2 × 150 bp, soit avec le système NextSeq 2000 (Illumina) en mode 2 × 100 bp. La qualité des lectures de séquence obtenues a été ajustée à l'aide de Trimmomatic (v.0.32)60 en utilisant les paramètres suivants : -phred33 LEADING:0 TRAILING:5 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36. Les lectures correspondant à l'assemblage de référence d'Homo sapiens GRCh38 et à une base de données locale de contaminants du réactif WGA-X16 (identité ≥95 % d'alignements ≥100 bp) ainsi que les lectures de faible complexité (contenant <5 % de tout nucléotide) ont été supprimées. Les lectures restantes ont été normalisées numériquement à l'aide de kmernorm v.1.05 (http://sourceforge.net/projects/kmernorm) en utilisant les paramètres -k 21 -t 30 -c 3, puis assemblées avec SPAdes (v.3.0.0)61 en utilisant les paramètres suivants : --careful --sc --phred-offset 33. Chaque extrémité des contigs obtenus a été coupée de 100 bp et seuls les contigs de plus de 2 000 bp ont été conservés. Les contigs correspondant à l'assemblage de référence H. sapiens GRCh38 et à une base de données locale des contaminants du réactif WGA-X16 (identité ≥ 95 % des alignements ≥ 100 bp) ont été supprimés. La qualité des assemblages de génomes résultants a été déterminée à l'aide de CheckM (v.1.0.7)62 et de l'analyse de fréquence tétramère63. Ce flux de travail a été évalué pour les erreurs d'assemblage à l'aide de trois cultures bactériennes de référence avec une complexité de génome et un pourcentage de GC différents, indiquant l'absence de bases non cibles et indéfinies dans les assemblages et les fréquences moyennes suivantes de mésassemblages, d'indels et de mésappariements par 100 kb : 1,5, 3,0 et 5,0, respectivement (réf. 16). Les 153 SAG dans lesquels des séquences d'ADN potentiellement contaminantes ont été détectées ont été supprimés de l'ensemble de données. Cela a abouti à 7 518 assemblages de génomes SAG organisés.

L'identité moyenne des acides aminés SAG par paires a été estimée à l'aide de CompareM64. Les régions du gène de l'ARNr 16S de plus de 500 pb ont été identifiées à l'aide d'alignements locaux fournis par BLAST par rapport à la base de données de référence SILVA organisée par CREST65, SILVAMod (v.128)66, et classées à l'aide d'une réimplémentation de l'algorithme du dernier ancêtre commun de CREST. Des arbres phylogénétiques ont été générés à partir de gènes d'ARNr SAG 16S presque complets (> 1 400 pb) en produisant d'abord des alignements à l'aide de l'aligneur SINA (v.1.2.11)67, puis en déduisant des relations phylogénétiques de probabilité maximale dans MEGACC (v.10.2.4) 68 avec 100 bootstraps. Les arbres ont été annotés et visualisés dans iTOL69. Les attributions taxonomiques des SAG ont été obtenues avec GTDB-Tk (v.1.4.1)70.

L'annotation fonctionnelle a d'abord été réalisée à l'aide de Prokka71 avec les bases de données par défaut Swiss-Prot fournies par le logiciel. Prokka a été exécuté une deuxième fois avec une base de données d'annotation de protéines personnalisée construite à partir de la compilation des entrées Swiss-Prot72 pour les archées et les bactéries. Les attributions taxonomiques ont été obtenues à l'aide de GTDB-Tk (v.1.4.1)70. Les séquences virales (contigs entiers ou partiels) ont été identifiées indépendamment à l'aide de trois outils d'identification virale bioinformatique préexistants : ViruScope73 (virus_prob > 0,95), VirSorter274 (catégories 1 et 2 uniquement) et DeepVirFinder75 (P > 0,95). Les résultats de ces trois outils ont été combinés. Les faux positifs (P < 0,95) ont été éliminés à l'aide de CheckV76.

La biomasse microbienne d'aliquotes d'eau de mer de 100 à 200 ml a été collectée sur des filtres stérilisés Supor de 0,2 µm (Pall Corporation) par filtration sous vide (pression maximale de 15 psi), puis congelée rapidement dans de l'azote liquide et stockée à -80 ° C jusqu'à l'extraction de l'acide nucléique . Les normes d'ARN MTST5 et MTST6 ont été ajoutées à chaque filtre avant l'extraction de l'ARN à une concentration estimée de 0,1 à 1 % de rendement total, comme décrit précédemment31. L'ADN et l'ARN ont été extraits en parallèle à l'aide du kit Zymobiomics DNA/RNA Miniprep (Zymo Research) et stockés à -80 ° C jusqu'à un traitement ultérieur. Les échantillons d'ARN ont ensuite été nettoyés et concentrés à l'aide du kit RNA Clean & Concentrator (Zymo Research). Les bibliothèques d'ADNc pour le séquençage du fusil de chasse Illumina ont été générées avec le KAPA RNA HyperPrep (Roche Sequencing). Des bibliothèques pour le séquençage shotgun d'ADN ont été générées à l'aide du kit Nextera XT (Illumina) conformément aux instructions du fabricant. Les deux types de bibliothèques ont été sélectionnés par taille avec BluePippin (Sage Science) réglé pour 370 pb « serré » et quantifiés à l'aide de la Tapestation (Agillent). Ces bibliothèques ont été séquencées à l'aide du système NextSeq 500 (Illumina) en mode 2 × 150 pb.

Après le séquençage, les lectures des bibliothèques d'ARN et d'ADN ont d'abord été découpées avec Trimmomatic (paramètres : -phred33 LEADING:0 TRAILING:5 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:75). Les lectures correspondant à l'assemblage de référence H. sapiens GRCh38 et à une base de données locale des contaminants du réactif WGA-X16 (identité ≥95 % d'alignements ≥100 bp), ainsi que les lectures de faible complexité (contenant <5 % de tout nucléotide) ont été supprimées. Les lectures restantes ont été fusionnées avec bbmerge en utilisant les paramètres suivants : k = 40, extend2 = 60, itérations = 5, loose='t', qtrim2='t'. Les lectures fusionnées ont été annotées taxonomiquement et fonctionnellement à l'aide du classificateur Kaiju77, après avoir remplacé la base de données génomique de référence sous-jacente par les SAG de cette étude, comme décrit précédemment3. Pour identifier les transcrits du gène de l'ARNr SSU, les lectures métatranscriptomiques ont été cartographiées sur la bibliothèque SILVA SSU66 (v.132) en utilisant Bowtie278 à 95 % d'identité sur toute la longueur de la lecture. L'abondance de chaque genre dans un échantillon (GAi ; cellules par ml) a été calculée comme suit :

où e est un facteur de normalisation pour les genres qui n'ont pas généré de SAG, et est défini comme :

où ai est le nombre de lectures du métagénome recrutées dans le genre i SAG, bi est la fraction moyenne de nucléotides dans les assemblages du genre i SAG qui codent pour les protéines, c est le nombre total de lectures dans le métagénome, di est la taille moyenne estimée du génome du genre i SAG et f est l'abondance totale de procaryoplancton, en cellules par ml. Ce calcul a été répété pour chaque jour d'échantillonnage.

Le nombre moyen de transcrits par cellule (TCi) a été calculé pour chaque genre et gène comme suit :

où ai est le nombre de lectures cartographiées sur le gène d'intérêt, b est le nombre de transcrits d'ARN MTST5 et MTST6 ajoutés à l'échantillon, c est le nombre de lectures cartographiées sur MTST5 et MTST6 et donc le rapport b/c est le nombre de transcrits par lecture, d est le volume d'échantillon recueilli sur le filtre en ml et GAii est l'abondance du genre (cellules par ml ; voir ci-dessus). Ce calcul a été répété pour chaque jour d'échantillonnage.

Le taux moyen de respiration cellulaire (ACRi ; amol O2 par cellule par heure) de chaque genre dans chaque échantillon d'eau de mer du GoM a été estimé comme suit :

où R est défini comme :

où ai est le taux de respiration moyen des cellules d'un genre donné récupérées dans les SAG avec des taux de respiration estimés dépassant la limite de détection (4 amol O2 par cellule par h), bi est le nombre de SAG classés comme appartenant au genre i (c'est-à-dire, le nombre de cellules actives dans le genre i), c est le nombre de tous les RSG SAG (également connu sous le nom de nombre de cellules actives séquencées dans l'échantillon), donc bi/c est la fraction de cellules actives dans le genre i, d est le total concentration de cellules actives avec une fréquence respiratoire estimée supérieure à la limite de détection (cellules par ml ; tableau supplémentaire 2) et z est égal à la fréquence respiratoire minimale détectée spécifique à la cellule, en amol O2 par cellule par h.

La quantité R est le nombre de cellules actives de genre i par ml. La quantité 0,5 × z[GAi − R] est un facteur de correction pour les cellules en dessous de la limite de détection. Du fait des sensibilités différentes des méthodes de mesure, il était possible que R soit parfois légèrement supérieur à GAi. Lorsque cela s'est produit, R a été fixé égal à GAi, ce qui fait que GAi − R = 0. Ce calcul a été répété pour chaque jour d'échantillonnage. Ce calcul n'a été effectué que pour les genres et échantillons pour lesquels au moins 3 SAG marqués RSG ont été identifiés.

Pour les principales mesures de concentration en nutriments, des sous-échantillons de 100 ml d'eau de mer GoM ont été prélevés à partir des mêmes échantillons qui ont été utilisés dans les analyses de génomique et de respiration unicellulaires. Ces échantillons ont été immédiatement filtrés à travers une membrane nucléoporeuse de 25 mm, filtre de taille de pores 0,4 µm (Whatman) et stockés à -80 °C jusqu'à l'analyse de NO3-, NO2-, NH4+ et PO43- sur un SEAL AA3 (Seal analytique limitée). De plus, des sous-échantillons d'eau de mer en triple, de 100 ml chacun, ont été prélevés sur chaque échantillon de terrain et filtrés sous vide sur des filtres en microfibre de verre (Whatman, GF/F) en 2 h. Chaque filtre GF/F a été extrait dans 10 ml d'acétone à 90 % à -20 °C pendant 24 à 48 h. Les extraits ont été analysés sur le fluorimètre 10-AU (Turner Designs) avant et après l'ajout de 50 µl de HCl à 10 %, et les concentrations de chlorophylle et de phaeophytine ont été déterminées comme décrit précédemment79

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les lectures de métagénome et de métatranscriptome et les assemblages de génome unicellulaire > 100 kb sont disponibles sous NCBI BioProject PRJNA846736. Toutes les lectures de métagénomes et de métatranscriptomes et les assemblages de génomes unicellulaires, y compris les 603 assemblages de génomes <100 ko, sont disponibles sur Open Science Framework (https://osf.io/r2un6).

Toutes les analyses ont été effectuées à l'aide d'un logiciel en libre accès. Des scripts personnalisés utilisés pour combiner les résultats et générer des images sont disponibles sur demande.

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Nous remercions B. Thompson, C. Mascena et B. Tupper du Single Cell Genomics Center du Bigelow Laboratory for Ocean Sciences pour la génération de données génomiques unicellulaires ; MA Moran, C. Smith et B. Nowinski pour leur aide à l'établissement d'un flux de travail transcriptomique quantitatif ; MA Moran et S. Giovannoni pour leurs commentaires sur le manuscrit ; les capitaines et les équipages du N/R Sarmiento de Gamboa, du N/R Ramon Margalef et du N/R Atlantis pour leur soutien en mer ; K. Ziervogel, K. Dykens et D. Moser pour leur aide dans la collecte d'échantillons pendant AT42-11 à bord du R/V Atlantis ; C. González-Pola et JM Arrieta pour avoir offert la possibilité de participer à leurs croisières. Le laboratoire INOCEN (IEO, PI M. Álvarez) a pris en compte l'analyse de l'oxygène dans RADPROF 2018. R. Santiago et A. Massanet pour leur aide dans l'analyse chimique des échantillons de Majorque. Des échantillons d'eau de mer du GoM ont été prélevés sur le quai du laboratoire Bigelow à East Boothbay et n'ont pas nécessité de permis. Des échantillons d'eau de mer de AT42-11 ont été prélevés avec le consentement du gouvernement du Canada. Ce travail a été soutenu par des prix de la US National Science Foundation (1826734 à RS, DE, BNO et NJP ; 1737017 à BNO ; et 1335810 à RS), le projet ARTEMIS du Austrian Science Fund (FWF) (P28781-B21 à GJH) et par la subvention de la Fondation Simons (827839 à RS).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Jacob H. Munson-McGee, Melody R. Lindsay

Laboratoire Bigelow pour les sciences océaniques, East Boothbay, ME, États-Unis

Jacob H. Munson-McGee, Melody R. Lindsay, Julia M. Brown, Timothy D'Angelo, Joe Brown, Laura C. Lubelczyk, David Emerson, Beth N. Orcutt, Nicole J. Poulton et Ramunas Stepanauskas

Département d'écologie fonctionnelle et évolutive, Université de Vienne, Vienne, Autriche

Eva Sintes et Gerhard J. Herndl

Instituto Español de Oceanografía-CSIC, Centro Oceanográfica de Baleares, Palma, Espagne

Eva Sintes

Université Purdue, West Lafayette, IN, États-Unis

Paxton Tomko

Département de microbiologie marine et de biogéochimie, Institut royal néerlandais de recherche sur la mer (NIOZ), Université d'Utrecht, Den Burg, Pays-Bas

Gerhard J. Herndl

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RS, BNO, NJP, DE et GJH ont conçu l'étude et obtenu le financement. MRL, TD et ES ont maintenu les cultures et mesuré la respiration. JHM-M., MRL, ES, TD, LCL, NJP et RS ont collecté les échantillons et généré les données. JHM-M., MRL, JMB, TD, JB et PT ont analysé les données. JHM-M., MRL, NJP et RS ont rédigé l'article avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Ramunas Stepanauskas.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Damien Eveillard et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Au cours d'une période allant de l'inoculation à la phase stationnaire, la concentration en oxygène a été mesurée dans des bouteilles scellées contenant des isolats cultivés de micro-organismes aquatiques. Des sous-échantillons de ces incubations ont été sondés avec RSG, après quoi la fluorescence et l'abondance des cellules ont été mesurées par cytométrie en flux. Une courbe d'étalonnage a été développée en comparant l'intensité moyenne de la fluorescence cellulaire à la consommation d'oxygène qui a été normalisée pour l'abondance des cellules dans chaque culture.

A. Diversité de la fluorescence RSG parmi les cellules dans les incubations d'isolats cultivés. B. Réglage des portes des cellules RSG-positives dans des diagrammes de dispersion de la dispersion latérale lumineuse (axe x) et de la fluorescence verte (axe y) des cellules individuelles. Chaque culture a été fermée individuellement, sur la base d'un échantillon témoin tué de cette culture.

UN B. Gating par cytométrie en flux du procaryoplancton marqué par le RSG. L'échantillon d'eau de mer du GoM a été prélevé le 2 avril 2019 et étiqueté avec RSG avant (A) ou après (B) un traitement thermique. Sont présentés les 100 000 premiers événements dans les deux échantillons (la majorité des événements sont sur la ligne de base). C. Intégralité de l'assemblage du génome de tous les SAG du golfe du Maine qui ont été sondés avec RSG (bleu, n = 2 572) ou SYTO-9 (orange, n = 1 632). Les cases indiquent les moyennes, les premier et troisième quartiles et les moustaches s'étendant jusqu'à 1,5 intervalle interquartile. D. Concentration de chlorophylle près de Boothbay Harbour (43,84° N, 69,64° O). Les lignes noires verticales indiquent les jours où les échantillons pour les analyses SAG ont été collectés. E. Relation entre les taux de respiration et la présence d'ADN viral dans des cellules individuelles. Chaque point de données représente un genre dans un seul échantillon de terrain. F. Optimisation de la longueur d'incubation RSG pour le procaryoplancton marin. L'abondance et l'intensité de fluorescence des cellules RSG-positives dans deux échantillons répétés sont indiquées.

A. SAG du 2 avril 2019. B. SAG du 9 juillet 2019. Dans les deux arbres, les isolats cultivés sont inclus comme références phylogénétiques et sont indiqués par une couleur de police rouge. Les arbres étaient enracinés dans la branche archée, lorsqu'elle était présente, et au milieu lorsqu'aucune archée n'est incluse.

Les cellules sont colorées par classe taxonomique, qui ont été déterminées par séquençage du génome d'une seule cellule.

Les gros points représentent les cellules qui ont été triées pour la génomique unicellulaire. Surbrillance en couleur sont les lignées avec des différences prononcées dans les taux de respiration entre les dates d'échantillonnage. En raison de changements dans la configuration du cytomètre en flux, nous n'avons pas pu estimer les taux de respiration dans les trois échantillons de 2017.

A. Cellules d'un échantillon prélevé dans le sud de l'océan Atlantique (32.35S, 44.02W) le 9 mars 2019. B. Cellules d'un échantillon prélevé dans le nord de l'océan Atlantique (43.00N, 11.33W) le 22 août 2018. Les arbres étaient enracinés au milieu. Les valeurs bootstrap > 0,75 sont indiquées par des cercles noirs.

A. Cellules d'un échantillon prélevé dans le nord-est de l'océan Pacifique (47.76N, 127.76E) le 23 mai 2019). B. Cellules d'un échantillon prélevé dans l'Atlantique équatorial (3.10N, 29.01W) le 20 mars 2019. Les arbres sont enracinés dans la branche archéenne lorsqu'elle est présente et au point médian lorsque la branche archéenne est absente. Les valeurs bootstrap > 0,75 sont indiquées par des cercles noirs.

A. Diffusion vers l'avant de la lumière et fluorescence RSG des cellules recueillies pendant la journée. B. Diffusion vers l'avant de la lumière et fluorescence RSG des cellules recueillies pendant la nuit. L'étiquette "R1" indique la position des cellules avec des taux de respiration intermédiaires qui avaient une abondance plus élevée pendant la nuit par rapport au jour. L'étiquette "R2" indique les positions des cellules avec des taux de respiration élevés. C. Taux de respiration spécifiques au genre pendant la journée (jaune, n = 190) et la nuit (bleu, n = 190). Sont présentés les genres à partir desquels au moins trois cellules RSG-positives ont été séquencées. La police rouge indique les genres avec une différence statistiquement significative des taux de respiration entre le jour et la nuit (test U de Mann-Whitney bilatéral, minimum 4 cellules par point dans le temps, valeur p AAA076-P13 = 0,010, valeur p UBA10364 = 0,038) . Les cases indiquent la médiane, les premier et troisième quartiles et les moustaches s'étendant jusqu'à 1,5 fois l'intervalle interquartile (IQR). Les valeurs supérieures ou inférieures à 1,5 IQR sont représentées par des cercles.

A. Cellules d'un échantillon prélevé à 14h00 le 24 août 2021. B. Cellules d'un échantillon prélevé à 02h00 le 25 août 2021. Les valeurs bootstrap > 0,75 sont indiquées par des cercles noirs. Les arbres sont enracinés dans la branche archéenne lorsqu'elle est présente et au milieu lorsque la branche archéenne est absente.

Isolats microbiens et conditions de culture utilisés dans l'étalonnage de fluorescence RSG (tableau supplémentaire 1); métadonnées d'échantillon de terrain (tableau supplémentaire 2); caractéristiques des SAG individuels (tableau supplémentaire 3); caractéristiques des genres SAG (tableau supplémentaire 4); et Intensité de fluorescence normalisée pour les kits de billes NFPPS-52-4K et RCP-30-5A (Spherotech, Lake Forest, IL) (tableau supplémentaire 5).

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Réimpressions et autorisations

Munson-McGee, JH, Lindsay, MR, Sintes, E. et al. Découplage des taux de respiration et de l'abondance dans le procaryoplancton marin. Nature 612, 764–770 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05505-3

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Reçu : 14 février 2022

Accepté : 01 novembre 2022

Publié: 07 décembre 2022

Date d'émission : 22 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-022-05505-3

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