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Dec 07, 2023

Estimation d'un biofilm

npj Biofilms et Microbiomes

npj Biofilms et Microbiomes volume 1, Numéro d'article : 15014 (2015) Citer cet article

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Les biofilms et plus particulièrement les biofilms hydrolysant l'urée intéressent la communauté médicale (par exemple, les infections des voies urinaires), les scientifiques et les ingénieurs (par exemple, la précipitation de carbonate induite par des microbes). Pour modéliser de manière appropriée ces systèmes, des taux de réaction spécifiques au biofilm sont nécessaires. Une méthode simple pour déterminer les vitesses de réaction spécifiques au biofilm est décrite et appliquée à un biofilm hydrolysant l'urée.

Les biofilms ont été cultivés dans de petits tubes de silicium et les concentrations d'urée dans les affluents et les effluents ont été déterminées. Immédiatement après l'échantillonnage, les tubes ont été sectionnés pour estimer le profil d'épaisseur du biofilm sur la longueur du tube. Les données sur la concentration d'urée et l'épaisseur du biofilm ont été utilisées pour construire un modèle inverse pour l'estimation du taux d'hydrolyse de l'urée.

Il a été constaté que l'hydrolyse de l'urée dans les biofilms d' Escherichia coli MJK2 est bien approchée par une cinétique de premier ordre entre des concentrations d'urée de 0, 003 et 0, 221 mol / l (0, 186 et 13, 3 g / l). Le coefficient de vitesse de premier ordre (k1) a été estimé à 23,2±6,2 h−1. Il a également été déterminé que l'advection dominait le système expérimental plutôt que la diffusion, et que l'hydrolyse de l'urée dans les biofilms n'était pas limitée par le transport diffusif. Au-delà du biofilm d'urée hydrolysant spécifique discuté dans ce travail, la méthode a le potentiel d'une large application dans les cas où les taux spécifiques au biofilm doivent être déterminés.

L'hydrolyse de l'urée par des micro-organismes a été largement démontrée comme une méthode efficace pour la production in situ d'alcalinité et la précipitation subséquente de minéraux carbonatés. A pH circumneutre, l'hydrolyse de l'urée (CO(NH2)2) peut s'écrire

où deux ions ammonium et un ion bicarbonate sont formés pour chaque molécule d'urée hydrolysée. De plus, un proton est consommé, ce qui élève le pH. Lorsque du calcium ou d'autres cations divalents sont présents, la précipitation de minéraux carbonatés peut être possible en raison d'une augmentation de la concentration de carbonate (CO32−).

La formation de minéraux carbonatés par uréolyse microbienne est importante en médecine en raison du rôle que les micro-organismes uréolytiques peuvent avoir dans la formation de calculs rénaux et urinaires ainsi que d'incrustations de cathéter.1,2 La formation de minéraux par uréolyse a également été étudiée de manière approfondie pour des applications techniques dans matériaux de construction3 et dans le sous-sol pour la réduction de la perméabilité, la stabilisation du sol et l'assainissement des contaminants.4 L'hydrolyse microbienne de l'urée est également intéressante dans les environnements de traitement des eaux usées industrielles et agricoles où une partie importante de l'azote total est attribuée à l'urée.5 Dans tous les systèmes mentionnés ci-dessus, en particulier lorsque le rapport surface/volume est élevé, une partie importante de l'activité uréolytique est susceptible d'être attribuée aux biofilms.

Un obstacle important dans la prédiction du comportement du système dans les systèmes contenant des biofilms est le manque de caractérisation quantitative et spécifique du transport réactif. Cette étude examine spécifiquement l'uréolyse dans un système de biofilm modèle pour faire la lumière sur l'environnement de transport réactif qui est susceptible d'être présent dans les systèmes qui ont, ou ont été stimulés pour avoir, une activité uréolytique. L'uréolyse dans les cultures planctoniques a fait l'objet d'études approfondies et un certain nombre d'études ont été menées pour quantifier les taux d'uréolyse moyens en volume dans des milieux poreux contenant des micro-organismes6–9 et des enzymes immobilisées.10,11 Les études les plus pertinentes se concentrent sur le taux de précipitation dans ces systèmes. laissant les caractéristiques de transport réactif à micro-échelle de l'uréolyse dans les biofilms largement non discutées.

Plutôt que d'adopter une approche de volume moyen, des biofilms uréolytiques ont été cultivés dans des tubes de silicium qui imitent l'environnement d'écoulement laminaire qui serait rencontré dans un pore du sol ou des voies urinaires. Aucun calcium ou autres cations qui provoqueraient une précipitation minérale n'ont été fournis au système afin que l'hydrolyse de l'urée puisse être étudiée en détail sans les complications introduites lors de la précipitation. Les précipitations ont le potentiel d'avoir un impact sur la cinétique d'hydrolyse de l'urée mais n'ont pas été étudiées dans cette étude. Les tubes de silicium ont été échantillonnés de manière destructive et coupés en sections minces pour obtenir un profil d'épaisseur de biofilm précis sur la longueur du tube. Les profils d'épaisseur de biofilm ont été combinés avec des mesures d'urée dans les affluents et les effluents pour obtenir un taux d'uréolyse par volume de biofilm (ici appelé taux spécifique au biofilm). Cet article fournit une méthode pour la mesure des taux de réaction efficaces dans les biofilms et une meilleure compréhension de l'environnement de transport réactif de l'hydrolyse de l'urée catalysée par le biofilm grâce à l'application de techniques de non dimensionnalisation.

Des biofilms d'Escherichia coli MJK2 (réf. 12) ont été cultivés dans des tubes en silicone de 10 cm de long et de taille 14 (Masterflex, Cole-Parmer, IL, USA) avec des concentrations d'urée dans l'influent allant de 0,011 à 0,221 mol/l (0,63 à 13,3 g/l ) à température ambiante (environ 20 °C). E. coli MJK2 possède un plasmide pJN105 qui a été modifié pour contenir l'opéron uréase de E. coli DH5α (pURE14.8) et porte également un mutant chromosomique gfp (gène de la protéine fluorescente verte).13,14 Les expériences ont été initiées par l'injection d'inoculum dans un assemblage de réacteur autoclavé et permettant aux cellules de se fixer pendant 1 h. Voir le matériel en ligne supplémentaire pour plus de détails sur la souche et la préparation de l'inoculum. Le débit a ensuite été démarré à 1,0 ml/h (nombre de Reynolds (Re) de 0,1 dans un tube propre) et maintenu à 1,0 ml/min pendant 10 jours avec une pompe à seringue multicanaux KDS220 (KD Scientific, Holliston, MA, USA). Le flux n'a été arrêté que pendant de courtes périodes pour échanger des seringues en plastique stériles de 60 ml remplies de milieu stérile. Le tube en silicone a été connecté à la seringue via un tube PEEK de petit diamètre intérieur (0,127 mm) (voir figure 1). Le tube de petit diamètre intérieur est destiné à minimiser le temps de séjour et à créer un environnement à cisaillement élevé qui n'est pas propice à la croissance du biofilm dans le tube affluent. Sans croissance de biofilm, le temps de séjour hydraulique moyen est de 4,5 s dans le tube d'affluent et de 12,1 min dans le réacteur à tube de silicium.

Un schéma de l'assemblage du réacteur tubulaire. Le milieu LB stérile est pompé à travers un tube de silicium de 10 cm de long et de 1,6 mm de diamètre intérieur (ID) avec un biofilm se développant sur les parois. Un tube d'influent de petit ID a été utilisé pour connecter la seringue au réacteur tubulaire. Une vanne à trois voies a été utilisée pour prélever des échantillons d'influent et l'extrémité aval du réacteur tubulaire a été déconnectée pour prélever des échantillons d'effluent.

Après 10 jours de croissance du biofilm, trois échantillons d'effluent consécutifs et un échantillon d'influent ont été prélevés. Les trois échantillons d'effluents consécutifs ont été prélevés pour démontrer le comportement à l'état d'équilibre. Les tubes qui présentaient au moins une concentration consécutive d'urée dans les effluents s'écartant de la moyenne des trois échantillons de 25 % n'ont pas été utilisés dans une analyse ultérieure. Une forte variation entre les répétitions en série indique un comportement transitoire tel que des événements de détachement de biofilm lors de l'échantillonnage, ce qui rend l'ensemble de données inadapté à la modélisation. Le dernier échantillon d'effluent prélevé dans chaque tube a été pris pour être représentatif et utilisé dans tous les modèles ultérieurs car il a été prélevé le plus près de la fin de l'expérience lorsque des échantillons de lames minces ont été préparés.

Des échantillons d'effluents ont été prélevés en déconnectant l'extrémité aval du tube et en laissant le milieu s'écouler dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml au débit expérimental pendant 1 h. L'échantillon d'influent a été prélevé en dernier en dirigeant le flux vers le tube d'échantillon par la vanne à trois voies, comme illustré à la figure 1. Les tubes de microcentrifugeuse vides ont été pesés, 100 μl de HCl à 3,8 % ont été ajoutés, pesés, l'échantillon ajouté et pesé à nouveau. Le pH final de l'échantillon d'environ 1,5 est efficace pour arrêter l'uréolyse car il a été démontré que l'enzyme uréase perdait son activité à un pH bas. Randor, PA, USA) et réfrigéré pour une mesure ultérieure des concentrations d'urée via HPLC. Immédiatement après le prélèvement de l'échantillon de liquide, les tubes de silicium ont été échantillonnés de manière destructive pour la détermination des profils d'épaisseur de biofilm par sectionnement mince comme décrit dans la section "Mesures d'épaisseur de biofilm".

Immédiatement après l'échantillonnage liquide, les tubes ont été disséqués pour déterminer un profil d'épaisseur de biofilm sur la longueur de chaque tube. Chaque tube de 10 cm a été coupé en cinq sections de 2 cm de long. Le centre de 1 cm de chaque section a été découpé et coupé en deux dans le sens de la longueur avec un scalpel chirurgical. Le liquide restant a été soigneusement évacué avec du papier de soie avant que le composé Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek Inc., Torrance, Californie, États-Unis) ne soit distribué sur la section transversale de chaque tube et placé sur de la neige carbonique pour geler. Une fois l'OCT entièrement congelé, la section transversale du tube a été décollée, laissant le biofilm intégré dans l'OCT. L'examen microscopique a montré qu'aucun biofilm significatif n'avait été laissé sur le tube. Le biofilm congelé et intégré a ensuite été complètement intégré en OCT dans un moule de cryofixation tissulaire. Les échantillons congelés ont été stockés à -20 ° C pour une coupe fine ultérieure.

Les échantillons de biofilm congelés ont été découpés en sections de 5 μm d'épaisseur et montés dans un cryostat Leica CM1850. Les coupes ont été montées sur des lames de microscopie chargées (Fisherbrand Superfrost Plus Stain, Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) et séchées à l'air. Cinq sections ont été prises pour chaque segment de tube. La protéine fluorescente verte produite par les bactéries a été imagée par microscopie à épifluorescence. Des coupes minces ont été imagées sur un microscope Nikon E-800 équipé d'une caméra CoolSNAP MYO CCD (Photometrics, Tucson, AZ, USA), d'une source de lumière PhotoFluor LM-75 (89 North Inc., Burlington, VT, USA), Nikon Plan Apo Objectif 10X/0.45 DIC L ∞/0.17 WD 4.0 et un filtre cube FITC (EX 480/30, DM 505 LP, EM 535/40). Les images brutes 16 bits étaient de 1 940 × 1 460 pixels avec une taille de pixel de 0,4499 μm. Toutes les images de fluorescence ont été obtenues avec un temps d'exposition de 2 s.

Les images brutes ont été seuillées dans le logiciel open source FIJI16 en utilisant la méthode du triangle automatique.17 La méthode du triangle s'est avérée fournir les résultats les plus représentatifs par rapport aux autres méthodes couramment utilisées telles que Otsu (1979). Les images seuillées ont été quantifiées pour déterminer les épaisseurs moyennes de biofilm (Lf). Cela a été fait en divisant la longueur d'arc calculée de la section de tube montrée dans l'image (0,923 mm, voir le tableau supplémentaire SI) par la surface de la section transversale du biofilm qui a été obtenue à partir de l'image seuillée. Images contenant des défauts importants ont été exclus de l'analyse. Les défauts comprenaient des particules de poussière, des bulles et des irrégularités géométriques qui entraîneraient des imprécisions dans les mesures d'épaisseur. L'épaisseur moyenne de toutes les répliques utilisables est présentée (voir les tableaux supplémentaires SIII–SX pour les calculs d'épaisseur et les données brutes). Les images n'ont pas été prises lorsque les échantillons ne contenaient aucun biofilm visible et l'épaisseur a été enregistrée à zéro. La figure 2 montre une lame mince typique et l'analyse qui y a été effectuée.

Un exemple représentatif d'une image en coupe mince. (a) Une image en lumière transmise montre une représentation qualitative du biofilm. (b) L'image de fluorescence, montrant le signal de la protéine fluorescente verte (GFP), est utilisée pour la quantification. (c) L'image de fluorescence GFP est seuillée pour différencier le biofilm (blanc) et le fond (noir), formant une image binaire. La zone du signal de biofilm est quantifiée et divisée par la longueur d'arc visible calculée (0,923 mm) pour calculer une épaisseur de biofilm moyenne représentative.

L'urée a été analysée par chromatographie liquide à haute pression (HPLC) avec dérivatisation dans l'échantillonneur automatique.12,19

Les réacteurs tubulaires ont été modélisés à l'aide de COMSOL Multiphysics version 4.3a (COMSOL Inc., Burlington, MA, USA) pour ajuster les paramètres cinétiques à la consommation d'urée mesurée sur la longueur des réacteurs tubulaires. Les réacteurs tubulaires ont été modélisés comme une géométrie axisymétrique tournée bidimensionnelle. Les équations de Navier-Stokes ont été résolues pour obtenir un champ d'écoulement et on a supposé qu'il n'y avait aucun écoulement de fluide dans le domaine du biofilm. Les données de la section mince ont été utilisées pour reconstruire le profil du biofilm pour chaque réacteur tubulaire. Il a été supposé que l'épaisseur du biofilm était constante pour des valeurs discrètes de x (voir la figure 3 pour les coordonnées du modèle) et l'épaisseur a été interpolée linéairement entre les points mesurés. L'épaisseur du biofilm n'a pas pu être mesurée immédiatement à l'influent ou à l'effluent des réacteurs (x = 0 et 10 cm) en raison d'artefacts potentiels dus au retrait des tubes de silicium du système expérimental, il a donc été supposé que Lf à x = 0 cm égalait Lf à x=1 cm et Lf à x=10 cm égalait Lf à x=9 cm. Le transport de l'urée a été calculé avec l'advection par le champ d'écoulement de Navier-Stokes et la diffusion fickienne. Aucune réduction du transport diffusif dans le domaine du biofilm n'a été prise en compte, de sorte que les caractéristiques de diffusion ont été supposées constantes tout au long de la simulation. Une analyse préliminaire a montré que la mise en œuvre d'une résistance accrue au transport de masse des solutés dans le biofilm comme dans la réf. 20 ont affecté le taux d'ajustement de manière minimale (différence <1 % dans les biofilms les plus épais, données non présentées). Les conditions aux limites et les hypothèses de modélisation sont indiquées à la figure 3.

Aperçu du modèle COMSOL avec conditions aux limites.

La vitesse de réaction d'hydrolyse de l'urée, R, a été supposée constante dans l'ensemble du biofilm dans chaque tube (indépendamment de la concentration) et limitée au domaine du biofilm (pas de réaction dans la phase liquide). La justification de l'hypothèse de vitesse de réaction constante suit dans la section « Caractérisation du transport réactif ». Les concentrations d'urée dans l'influent et l'effluent sont connues, de sorte que le taux d'hydrolyse de l'urée a été ajusté de sorte que les concentrations déterminées expérimentalement correspondent au modèle. La concentration d'urée à la limite de sortie n'est pas constante dans l'espace (c'est-à-dire sur la section transversale de la sortie); ainsi, plutôt que de minimiser directement la différence entre les concentrations modélisées et expérimentales, la différence entre le flux modélisé et expérimental d'urée moyenné sur la section transversale du tube a été minimisée. La dernière des trois concentrations d'urée dans l'effluent a été considérée comme la concentration moyenne représentative sur la section transversale du tube car elle a été prise le plus près du moment de l'échantillonnage destructif. Le flux d'urée de l'effluent connu, JEF, peut être calculé en multipliant la concentration de l'effluent, CEF, par le débit volumétrique, Q tel que

CEF est une valeur moyenne et bien mélangée. Le flux d'urée total de l'effluent modélisé, J'EF, a été calculé en intégrant sur la surface de la phase liquide à l'effluent de telle sorte que

où u est la composante x de la vitesse du fluide, C est la concentration locale d'urée et ID est le diamètre intérieur du tube (1,6 mm). Le modèle a été exécuté de manière itérative où le taux d'uréolyse du biofilm variait de telle sorte que la somme de l'erreur quadratique entre JEF et J'EF soit minimisée. Le module d'optimisation COMSOL a été utilisé pour trouver un taux d'hydrolyse de l'urée, R, qui minimise l'erreur quadratique, (JEF−J'EF)2, en utilisant la méthode Nelder–Mead21,22 avec une tolérance d'ajustement non dimensionnelle de 10−6.

Les valeurs de vitesse ajustées pour chaque tube ont été compilées dans un ensemble de données qui représente les vitesses de réaction à une gamme de concentrations d'urée. Une concentration moyenne d'urée dans le volume du biofilm, CUrea,BF, a été calculée pour chaque tube et a été considérée comme la concentration d'urée représentative correspondant au taux qui a été ajusté. Une relation de taux de Michaelis–Menten (M–M), Rm–m, a été ajustée aux données compilées à l'aide de l'outil d'ajustement de courbe des moindres carrés (cftool) dans MATLAB R2012a (The MathWorks, Inc., Natick, MA, USA) :

Rmax est le taux d'uréolyse maximal et km est un demi-coefficient de saturation. Il a été émis l'hypothèse que la relation M – M correspondrait le mieux aux données, mais d'autres relations de taux étaient adaptées à la comparaison. Pour une réaction d'ordre n , par rapport à la concentration d'urée, une loi de vitesse généralisée peut s'écrire

Les relations de premier ordre (n = 1, linéaire) et d'ordre zéro (n = 0, taux constant) ont été utilisées précédemment pour décrire l'uréolyse microbienne7,12,23,24, elles ont donc également été incluses dans l'analyse de régression.

Une hydrolyse mesurable de l'urée a été observée dans tous les réacteurs tubulaires après 10 jours de fonctionnement. Les concentrations d'urée dans l'influent variaient entre 0,011 et 0,221 mol/l. Les concentrations des effluents variaient entre 0,003 et 0,208 mol/l, y compris tous les réplicats en série. Les tubes 5, 10 et 11 ont été éliminés de l'analyse car la condition d'état d'équilibre n'était pas remplie (> 25 % d'écart par rapport à la moyenne). Le lecteur est renvoyé au tableau supplémentaire SII pour toutes les mesures d'urée.

Des profils de biofilm ont été obtenus avec succès à partir de 11 cycles de réacteurs tubulaires. Les épaisseurs de biofilm variaient de 0,6 à 222,0 μm avec une moyenne pour toutes les observations de 18,7 μm. En supposant un écoulement nul à travers le biofilm, un écoulement laminaire est attendu dans tous les réacteurs tubulaires (un Re = 0,18 maximum a été calculé pour le réacteur avec le biofilm le plus épais observé).

Cinq mesures répétées de l'épaisseur du biofilm ont été recueillies pour chaque point du profil. 5,5% des mesures ont été éliminées de l'analyse en raison d'irrégularités apparentes telles que des bulles dans le milieu de coupe, des particules de poussière et des sections déformées. Toutes les mesures d'épaisseur de biofilm présentées ont été au moins mesurées en double avec une moyenne de 4,7 mesures par valeur d'épaisseur. Les mesures de biofilm brut peuvent être trouvées dans le matériel en ligne supplémentaire et les profils moyens utilisés dans le modèle peuvent être trouvés dans la figure 4.

Concentration d'urée telle que prédite par le modèle de transport réactif pour chaque réacteur tubulaire utilisé dans l'analyse. La carte de concentration pour tous les tubes est tracée en utilisant la même échelle de couleurs, ce qui montre clairement que chaque tube avait une plage de concentration d'urée différente mais à l'intérieur de chaque tube très étroite. Les profils de biofilm pour chaque tube obtenus à partir des données de microscopie sont représentés par des lignes blanches dans chaque panneau. Notez les très légers gradients de concentration radialement vers l'extérieur à partir du centre des tubes.

Il existe certaines sources d'erreur distinctes associées à l'expérience du réacteur tubulaire qui doivent être traitées. On s'attend à ce que la source d'erreur la plus importante soit dans la définition du profil d'épaisseur du biofilm. Si l'épaisseur du biofilm dans tout le tube n'est pas bien caractérisée, les taux calculés ne sont pas précis car le taux d'ajustement dépend implicitement de la quantité de biofilm présent. Il existe cinq sources potentielles d'erreur pour l'estimation du profil d'épaisseur du biofilm : (i) le biofilm à l'influent et à l'effluent des tubes ne peut pas être quantifié avec précision, (ii) l'épaisseur du biofilm entre les points de mesure peut ne pas être bien approchée par une interpolation linéaire, (iii) l'épaisseur du biofilm peut ne pas être constante sur toute la section transversale du tube et (iv) des événements de détachement importants peuvent se produire lors de l'échantillonnage pour analyse aqueuse.

Dans les trois premières sources d'erreur potentielles, le problème est que le tube entier et le biofilm à l'intérieur de ce tube ne peuvent raisonnablement pas être imagés en trois dimensions. Ces erreurs sont directement liées au manque de capacité à échantillonner à une résolution spatiale élevée et peuvent être considérées comme des erreurs aléatoires. On peut s'attendre à ce que les erreurs aléatoires dans ce système aient la même probabilité de surestimation que de sous-estimation. En d'autres termes, le régime d'échantillonnage est tout aussi susceptible de manquer une zone épaisse de biofilm qu'une zone mince. Bien que des techniques plus avancées soient nécessaires, le problème de faible résolution spatiale peut être résolu. Les techniques d'imagerie tridimensionnelle telles que la microtomographie à rayons X25-27 et l'imagerie par résonance magnétique nucléaire28,29 ont le potentiel d'imager des systèmes de biofilm simples et de mieux lier la géométrie du biofilm à des estimations efficaces de la vitesse de réaction.

L'erreur associée aux événements de détachement pendant le processus d'échantillonnage ne peut pas être quantifiée ici, mais le signe de l'erreur et ses effets sont connus. Si un grand événement de détachement devait se produire pendant l'échantillonnage aqueux ou entre l'échantillonnage et la coupe mince, le profil du biofilm pendant l'échantillonnage aqueux serait inconnu, mais il devait être plus épais que ce qui serait montré dans les coupes minces. Cela conduirait toujours à une surestimation de la vitesse de réaction effective dans ce tube particulier en raison de la sous-estimation du volume du biofilm. Comme pour l'autre classe d'erreurs aléatoires, ce problème pourrait être minimisé grâce à l'utilisation de techniques d'imagerie tridimensionnelle plus avancées. Ces techniques plus avancées devraient encore être utilisées avec précaution pour ne pas perturber le biofilm.

Il existe une autre source potentielle d'erreur qui n'est pas liée à l'estimation de l'épaisseur du biofilm. Ceci est lié à l'hypothèse que le biofilm est homogène. Il pourrait y avoir des différences dans la densité cellulaire, la production d'enzymes (uréase dans ce cas) ou l'activité métabolique générale qui pourraient entraîner des inexactitudes lors de l'estimation des constantes de vitesse. Cette possibilité n'a pas été étudiée directement dans cette étude, mais son influence ne peut être exclue et devrait faire l'objet de travaux futurs. Les systèmes avec limitation du donneur ou de l'accepteur d'électrons seraient particulièrement intéressants pour de telles études futures.

Le nombre de Damköhler (Da) est défini comme l'échelle de temps du transport convectif divisée par l'échelle de temps de la réaction dans un volume de contrôle.30 Pour une réaction de premier ordre, le nombre de Damköhler peut être défini comme

où τ est le temps moyen de rétention d'eau. Cette expression standard pour Da nécessite une modification pour un système avec des taux définis comme se produisant uniquement dans la phase de biofilm. L'équation (6) suppose que la réaction se produit dans tout le volume pour lequel τ est calculé (le volume de liquide). Dans ce cas, la réaction ne se produit pas dans le volume de liquide, de sorte que la vitesse de transport et les vitesses de réaction doivent être normalisées pour les volumes dans lesquels elles se produisent.

De même, le nombre de Péclet (Pe) peut être défini comme le rapport du taux d'advection d'un soluté au taux de diffusion du même soluté.31 Le nombre de Péclet peut être exprimé comme

où D est le coefficient de diffusion, qui est de 1,38×10−9 m2/s pour l'urée dans de l'eau pure à 25 °C (réf. 31), v est une vitesse moyenne du fluide et L est une échelle de longueur représentative. Les valeurs de v et L peuvent être choisies en fonction de ce qui est caractérisé dans le système. Dans ce cas, le comportement axial et radial est intéressant, donc deux nombres de Péclet sont définis. Le premier, Pex, caractérise le comportement axial où la vitesse est considérée comme l'amplitude moyenne de la composante x de la vitesse, vx. Le second, Per, caractérise le comportement radial où la vitesse est considérée comme la grandeur moyenne de la composante r de la vitesse, vr. Les échelles de longueur sont différentes pour le comportement radial et axial. La longueur du tube, ltube, est l'échelle de longueur pour l'écoulement axial et le diamètre du tube dtube est l'échelle de longueur pour l'écoulement radial tel que

et

Le dernier paramètre sans dimension considéré est le module de Thiele (ϕ) qui est le rapport de l'échelle de temps de réaction sur l'échelle de temps de diffusion. Le module de Thiele est simple à calculer pour les réactions de premier ordre.31

L'échelle de longueur (L) est ici une épaisseur de biofilm (Lf) car le module de Thiele, dans ce cas, est calculé comme une métrique pour quantifier la limitation de diffusion potentielle des biofilms dans ce système. L'épaisseur du biofilm n'est pas constante dans ces systèmes, de sorte que les valeurs moyennes élevées et basses pour chaque tube sont utilisées pour limiter le comportement global. Le tableau 1 montre les paramètres sans dimension calculés (moyenne, minimale et maximale) pour chaque réacteur tubulaire de l'étude. Les valeurs utilisées dans le calcul des paramètres sans dimension ont été tirées du modèle d'éléments finis décrit dans la section "Ajustement des paramètres cinétiques"

En général, l'analyse des paramètres sans dimension montre que l'advection domine le système (plutôt que le transport diffusif et l'hydrolyse de l'urée) et que les biofilms ne sont pas limités par la diffusion. Le nombre de Damköhler montre que, pour ce système particulier, l'échelle de temps du transport par advection est plus grande que l'échelle de temps de la réaction. Les nombres axiaux de Péclet sont tous bien supérieurs à un (Pex ≫ 1) indiquant que le système est fortement dominé par l'advection. Seule une petite fraction du transport axial de l'urée peut contribuer à la diffusion. Le nombre radial de Péclet indique que les transports d'urée par advection et par diffusion sont plus équilibrés, les transports par diffusion et par advection contribuant plus également dans la direction radiale.

Deux caractéristiques principales contrôlent Per en supposant un coefficient de diffusion constant. Premièrement, le débit en vrac affecte Per ; un débit global plus élevé du système se traduira par des vitesses globales plus élevées, y compris des vitesses radiales. Deuxièmement, l'hétérogénéité du profil du biofilm affecte directement les vitesses radiales ; à mesure que le profil du biofilm devient plus constant (c'est-à-dire que le plus proche de Lf est égal à toutes les valeurs de x), la vitesse radiale moyenne diminue, diminuant ainsi Per. On peut également s'attendre à ce que l'hétérogénéité du débit et de l'épaisseur du biofilm soit liée. Bien que cette relation physiologique n'ait pas été étudiée ici, il a été démontré que les biofilms s'adaptent à leurs environnements de cisaillement et de transport de soluté. Il a été démontré que les biofilms d'E. coli adaptent leur architecture à des conditions hydrodynamiques et nutritives spécifiques. Plus précisément, lorsque les nutriments sont fournis en excès (comme prévu dans cette étude en raison des valeurs élevées de Da et de ϕ faibles), il a été démontré que les biofilms d'E. coli s'adaptent pour résister au stress de cisaillement.34

Le module de Thiele était le paramètre sans dimension le plus variable dans le système, mais toutes les valeurs se sont révélées inférieures à un, ce qui indique que l'échelle de temps de diffusion est généralement plus courte que l'échelle de temps de réaction. Cela signifie que l'hydrolyse de l'urée dans les biofilms de cette étude n'est pas fortement limitée par la diffusion. En d'autres termes, les concentrations de liquide en vrac devraient être approximativement égales aux concentrations trouvées dans le biofilm (c'est-à-dire qu'il n'y a pas de gradients abrupts de concentration d'urée). Cette découverte est une validation importante de l'approche qui a été adoptée pour déterminer les constantes de vitesse cinétique où la vitesse de réaction et la concentration d'urée du biofilm correspondante (CUrea, BF) dans chaque tube étaient supposées constantes. Des preuves visuelles du comportement du petit module de Thiele peuvent également être trouvées sur la figure 4 où la concentration d'urée ne semble pas changer de manière significative dans les biofilms par rapport au fluide en vrac.

Les réacteurs tubulaires qui répondaient aux critères d'état d'équilibre ont été modélisés à l'aide de modèles d'éléments finis individuels, et le taux d'hydrolyse de l'urée, R, a été modifié jusqu'à ce que les différences entre les flux d'urée modélisés et expérimentaux soient minimisées. La concentration représentative correspondant à la vitesse de réaction calculée a été supposée être la concentration moyenne d'urée dans le volume de biofilm de chaque tube.

Les données résultantes des modèles d'éléments finis ont permis une analyse de régression en tenant compte de Michaelis – Menten (M – M), des modèles de taux de premier ordre et d'ordre zéro. Un tracé de la vitesse de réaction d'hydrolyse de l'urée par rapport à la concentration représentative ainsi que les ajustements du modèle de vitesse peuvent être trouvés à la figure 5. Les modèles M – M et de premier ordre correspondent le mieux aux données (erreur quadratique moyenne de 1,01 et 0,97 mol/(l h) respectivement), alors que l'ordre zéro était un mauvais ajustement par rapport aux autres (erreur quadratique moyenne = 1,56 mol/(l h)). Les ajustements du modèle M–M et du premier ordre ne sont pas statistiquement différents à 95 % de confiance sur la plage de concentrations considérée dans cette étude. Les constantes de vitesse pour le modèle M–M ont été estimées à km=0,55 mol/l et rmax=15,9 mol/(l h) et pour le modèle de premier ordre k1=23,2±6,2 h−1 (± est l'intervalle de confiance à 95 % ).

Concentration moyenne d'urée dans le volume du biofilm par rapport au taux estimé d'hydrolyse de l'urée. Les points modélisés correspondent au taux calculé par les modèles éléments finis en fonction de la concentration moyenne en urée dans le volume du biofilm, CUrea,BF. Les barres d'erreur représentent la plage de concentration d'urée dans le volume du biofilm telle qu'estimée par les modèles d'éléments finis. Les points sont étiquetés avec les numéros de réacteur tubulaire à partir desquels ils ont été obtenus (voir par exemple la figure 4).

La démonstration du comportement de premier ordre est importante pour modéliser des systèmes plus complexes et constitue une découverte importante dans ce travail. D'autres ont utilisé la cinétique de premier ordre pour les systèmes d'uréolyse impliquant une minéralisation induite par l'uréolyse ; 7,23 cependant, l'applicabilité de ce modèle était restée non démontrée pour tout système de biofilm jusqu'à présent. Pour les réactions obéissant à une cinétique M – M, comme cela a été montré pour l'hydrolyse de l'urée, 11, 15, 35, on suppose généralement que la cinétique de premier ordre ne doit être appliquée qu'aux systèmes où le substrat de réaction est à faible concentration (C ≪ km). Les résultats présentés ici indiquent que les valeurs cinétiques publiées à partir d'expériences biologiques enzymatiques ou planctoniques pures peuvent ne pas être appropriées pour une utilisation dans des systèmes où les cellules attachées et les biofilms sont le catalyseur principal. La limitation de la diffusion est couramment citée comme la raison du comportement cinétique différent dans les biofilms, mais les résultats de ce travail suggèrent que des différences cinétiques peuvent se produire même sans preuve de limitations importantes du transport de masse par diffusion.

La limitation du transport de masse de l'urée a été considérée dans cette analyse indépendamment des autres solutés. À titre d'exemple, la limitation de l'oxygène pourrait également être étudiée puisque les biofilms dans la nature sont souvent au moins partiellement limités en oxygène. Dans cette étude, on ne s'attend pas à ce que l'oxygène soit limitant en raison de la perméabilité élevée aux gaz des tubes en silicone utilisés, mais dans les systèmes naturels, l'oxygène peut être appauvri, ce qui pourrait avoir un impact sur la cinétique de l'hydrolyse de l'urée. En conséquence, les limitations de transport de masse d'autres solutés peuvent devoir être prises en compte dans d'autres systèmes lors de l'application de l'approche décrite dans cette étude.

L'étude présentée a des applications directes et indirectes. L'application la plus directe de ces travaux est la poursuite des études en laboratoire utilisant E. coli MJK2. Les paramètres cinétiques spécifiques au biofilm obtenus dans cette étude peuvent être utilisés en conjonction avec des outils tels que la microscopie confocale, les cellules d'écoulement et la modélisation par éléments finis dans des systèmes plus complexes pour étudier plus avant les gradients chimiques locaux dans les biofilms uréolytiques. Les systèmes qui seraient particulièrement bien adaptés comprennent les cathéters urétéraux1 et la précipitation de carbonate microbien induite par l'hydrolyse de l'urée.3,4

Au-delà des systèmes d'hydrolyse de l'urée en particulier, cet article présente une méthode robuste pour la caractérisation systématique des taux de réaction efficaces dans les biofilms dans les systèmes d'écoulement. La petite échelle de la méthode du réacteur tubulaire présente des avantages par rapport aux réacteurs à biofilm de laboratoire plus courants tels que le réacteur CDC,36 les réacteurs annulaires37 ou les réacteurs goutte à goutte.38 Les principaux avantages concernent le coût et la réduction des déchets. Le réacteur tubulaire simple ne nécessite aucun équipement spécialisé autre qu'une pompe à seringue ou une pompe similaire qui fournit un débit constant et lent. L'environnement de cisaillement peut également être facilement adapté aux exigences spécifiques de l'étude en faisant varier le débit ou la taille du tube. La méthode du réacteur tubulaire est également bien adaptée aux études où des matières dangereuses sont utilisées. Les études axées sur la quantification de la dégradation des substances dangereuses par les biofilms peuvent trouver une utilité dans les études sur les petits réacteurs tubulaires, car des expériences pourraient être conçues pour produire une quantité minimale de déchets dangereux (par exemple, les aromatiques chlorés, les hydrocarbures, les nitroaromatiques et les produits pharmaceutiques). Des études où des substrats à coût élevé sont utilisés (par exemple, des composés d'isotopes stables) peuvent également trouver une utilisation dans le système de réacteur tubulaire. La méthode du réacteur tubulaire présente également des inconvénients par rapport aux approches à plus grand volume. Certaines études peuvent nécessiter des volumes d'échantillons plus importants pour de multiples analyses, ce qui rend l'utilisation d'un tel système à faible débit peu pratique.

Le système particulier qui a été analysé dans ce travail s'est avéré ne pas être limité par la diffusion et la plage de concentration pour chaque tube était petite. Dans ce cas, un calcul beaucoup plus simple aurait pu être effectué pour déterminer la vitesse de réaction volumétrique efficace dans le réacteur à biofilm. Lorsque la concentration dans l'ensemble du volume du biofilm peut être considérée comme constante, une vitesse de réaction moyenne dans le biofilm de chaque tube peut être déterminée en calculant simplement le volume du biofilm et en le divisant par la différence de concentration à travers le tube. L'hypothèse de concentration constante ne peut pas être faite pour tous les systèmes, c'est pourquoi l'approche de modélisation inverse plus rigoureuse a été présentée ici. En général, si des molécules plus grosses avec des coefficients de diffusion plus faibles font l'objet d'une analyse cinétique ou si des biofilms plus épais sont présents, la méthode la plus rigoureuse serait toujours nécessaire.

La détermination des taux de réaction spécifiques au biofilm est importante pour la modélisation précise à micro-échelle des systèmes de biofilm. Dans ce travail, les coefficients de vitesse d'hydrolyse de l'urée spécifiques au biofilm ont été déterminés (à la fois Michaelis – Menten et modèles de vitesse de premier ordre) dans un système de réacteur tubulaire. Il a été constaté que pour les conditions chimiques et hydrodynamiques présentes dans cette étude, un modèle de vitesse de premier ordre (linéaire) correspond à la vitesse de réaction par rapport aux données de concentration ainsi qu'au modèle Michaelis-Menten qui est plus difficile à utiliser par calcul. Ce travail ainsi que la caractérisation précédente d'E. coli MJK2 en culture planctonique font de l'organisme un outil précieux pour l'étude de divers aspects de l'uréolyse dans les biofilms. Les applications incluent des sujets de recherche en médecine, en sciences de l'environnement et en ingénierie. Au-delà des résultats spécifiques liés à l'uréolyse, la méthode présentée dans ce travail a des applications plus larges à d'autres biofilms où un taux de réaction spécifique au biofilm doit être déterminé.

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Les auteurs ont été financés par la National Science Foundation via le prix NSF n° DMS-0934696 et par les numéros de subvention du département américain de l'énergie DE-FG-02-09ER64758, DE-FE0004478, DE-FE0009599 et DE-FG02-13ER86571. JMC a également été soutenu par une bourse NSF-IGERT en systèmes géobiologiques à la Montana State University (DGE-0654336).

Centre d'ingénierie du biofilm, Université d'État du Montana, Bozeman, MT, États-Unis

James M Connolly, Benjamin Jackson, Adam P Rothman et Robin Gerlach

Département de génie chimique et biologique, Montana State University, Bozeman, MT, États-Unis

James M Connolly, Adam P Rothman et Robin Gerlach

Département des sciences mathématiques, Montana State University, Bozeman, MT, États-Unis

Benjamin Jackson

Département de mathématiques, Temple University, Philadelphie, PA, États-Unis

Isaac Klapper

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JMC a rédigé le manuscrit. JMC et RG ont développé le plan expérimental. JMC et APR ont réalisé les expériences. JMC a développé le modèle inverse qui a été évalué de manière critique par BJ, IK et RG. Le manuscrit a été édité par IK et RG et tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit.

Correspondance avec Robin Gerlach.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Des informations supplémentaires accompagnent l'article sur le site Web npj Biofilms and Microbiomes (http://www.nature.com/npjbiofilms)

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

Connolly, J., Jackson, B., Rothman, A. et al. Estimation d'une vitesse de réaction spécifique à un biofilm : cinétique d'hydrolyse bactérienne de l'urée dans un biofilm. npj Biofilms Microbiomes 1, 15014 (2015). https://doi.org/10.1038/npjbiofilms.2015.14

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Reçu : 26 novembre 2014

Révisé : 26 avril 2015

Accepté : 04 juillet 2015

Publié: 16 septembre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/npjbiofilms.2015.14

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