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Nov 04, 2023

Lignes directrices pour mesurer les espèces réactives de l'oxygène et les dommages oxydatifs dans les cellules et in vivo

Nature Métabolisme volume 4,

Nature Metabolism volume 4, pages 651–662 (2022)Citer cet article

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Les rôles multiples des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et leurs conséquences pour la santé et la maladie émergent dans les sciences biologiques. Ce développement a conduit des chercheurs peu familiers avec les complexités des ROS et leurs réactions à utiliser des kits et des sondes commerciaux pour mesurer les ROS et les dommages oxydatifs de manière inappropriée, traitant les ROS (une abréviation générique) comme s'il s'agissait d'une entité moléculaire discrète. Malheureusement, l'application et l'interprétation de ces mesures sont pleines de défis et de limites. Cela peut conduire à des affirmations trompeuses dans la littérature et entraver les progrès, malgré un ensemble de connaissances bien établi sur la meilleure façon d'évaluer les ROS individuels, leurs réactions, leur rôle en tant que molécules de signalisation et les dommages oxydatifs qu'ils peuvent causer. Dans cette déclaration de consensus, nous éclairons les problèmes qui peuvent survenir avec de nombreuses approches couramment utilisées pour mesurer les ROS et les dommages oxydatifs, et proposons des lignes directrices pour les meilleures pratiques. Nous espérons que ces stratégies seront utiles à ceux qui trouvent que leurs recherches nécessitent une évaluation des ROS, des dommages oxydatifs et de la signalisation redox dans les cellules et in vivo.

Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) (Encadré 1) sont intimement impliquées dans la signalisation redox mais, dans certaines situations, peuvent également entraîner des dommages oxydatifs. Par conséquent, ils ont des rôles à la fois physiologiques et physiopathologiques en biologie1,2,3,4. Par conséquent, les chercheurs de divers domaines ont souvent besoin de mesurer les ROS, d'évaluer les événements oxydatifs et d'étudier leur importance biologique en utilisant des antioxydants (Encadré 1) ou des inhibiteurs pour moduler les phénomènes observés. Il existe de nombreux tests et kits commerciaux disponibles, mais leur utilisation et leur interprétation sont difficiles et ouvertes aux artefacts. Il existe un domaine bien établi de biophysique/biochimie/chimie axé sur l'identification des ERO, leurs réactions chimiques et les produits des dommages oxydatifs. Cependant, comme dans de nombreux domaines spécialisés, cette littérature peut être difficile à interpréter par ceux qui travaillent à l'extérieur du domaine. Souvent, des problèmes surviennent en raison de la dépendance à l'égard des kits commerciaux qui prétendent mesurer les « ROS » ou les « dommages oxydatifs », ou de l'utilisation d'« antioxydants » en termes généraux, lorsque les progrès nécessitent la compréhension de mécanismes moléculaires spécifiques.

Pour aborder ces points, ce groupe international a défini des lignes directrices sur la nomenclature et la mesure des ERO, des réactions oxydatives et des dommages oxydatifs. Nous nous concentrons sur les techniques utilisées pour mesurer les ROS et les dommages oxydatifs. Ceux-ci peuvent être appliqués à leur rôle dans la pathologie, mais il est également important de noter que les changements dans les niveaux de ROS et les changements conséquents dans l'activité des processus cellulaires sensibles au redox sont au cœur du domaine de la signalisation redox1,2,3,4 . Nous espérons que ces lignes directrices seront utiles aux chercheurs qui se retrouvent à mener des expériences dans ce domaine. Ces sujets, et en fait les approches que nous préconisons, ont été couverts par de nombreuses revues dans le passé1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 et que les chercheurs sont fortement encouragés à lire. Nous distillons ici les points clés qui sous-tendent cette déclaration consensuelle.

Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont un terme collectif pour les espèces dérivées de l'O2 qui sont plus réactives que l'O2 lui-même. Le terme comprend non seulement l'anion radical superoxyde (O2•−) et certains autres radicaux oxygénés, mais aussi certains dérivés non radicalaires de l'O2 tels que le peroxyde d'hydrogène (H2O2), l'acide hypochloreux (HOCl) et le peroxynitrite/acide peroxynitreux (ONOO− /ONOOH). Par conséquent, tous les radicaux oxygène sont des ROS, mais tous les ROS ne sont pas des espèces radicalaires (ces dernières étant définies comme une espèce avec un ou plusieurs électrons non appariés). « Réactif » est un terme relatif ; O2•− et H2O2 sont sélectifs dans leurs réactions avec les molécules biologiques, laissant la plupart d'entre elles indemnes, alors que •OH attaque tout (tableau 1).

Antioxydant est un terme souvent utilisé mais difficile à définir clairement.

Lorsque les ROS sont générés in vivo, de nombreux antioxydants entrent en jeu. Leur importance relative dépend :

quel ROS est généré, en quelle quantité et sur quelle durée

comment et où il est généré

quelle cible de dommages par ROS est mesurée

Une définition d'un antioxydant est "toute substance qui retarde, prévient ou supprime les dommages oxydatifs d'une molécule cible"1. Il n'y a pas de « meilleur » antioxydant universel : différents antioxydants réagissent avec différents ROS à des taux variables, agissent à divers endroits et protègent différentes cibles moléculaires. Une définition alternative est "une substance qui réagit avec un oxydant pour réguler ses réactions avec d'autres cibles, influençant ainsi les voies de signalisation biologique dépendantes de l'oxydoréduction et/ou les dommages oxydatifs".

Dommages oxydatifs : les dommages biomoléculaires causés par l'attaque des ROS sur les constituants des organismes vivants. Des niveaux accrus de dommages oxydatifs peuvent résulter d'une production accrue de ROS, mais également d'une diminution des processus de réparation ou d'élimination, par exemple, l'incapacité à éliminer les protéines oxydées ou à réparer suffisamment rapidement l'ADN oxydé : les deux peuvent se produire dans certaines maladies.

Biomarqueur : peut être défini comme toute substance, structure ou processus qui peut être mesuré dans le corps ou ses produits et qui influence ou prédit l'incidence d'un résultat ou d'une maladie54.

Un problème qui sous-tend la mesure des ROS et des dommages oxydatifs et l'utilisation des « antioxydants » est le manque de précision dans l'utilisation de ces termes. ROS est une abréviation qui couvre un large éventail d'espèces chimiques avec différentes propriétés, réactivités et interactions (encadré 1, tableau 1). Par exemple, une espèce réactive importante trouvée en biologie, l'anion radical superoxyde (O2•−), est formée par la réduction à un électron de l'oxygène (O2). En soi, O2•− est peu réactif, sauf avec un autre radical monoxyde d'azote (•NO) pour former du peroxynitrite11, ou avec des clusters Fe–S dans les protéines12. De même, le peroxyde d'hydrogène (H2O2), formé par diverses enzymes oxydases1,4 et par l'action de la superoxyde dismutase (SOD), est peu réactif, ce qui permet son utilisation comme molécule de signalisation importante in vivo2,4. Néanmoins, en présence d'ions ferreux ou cuivreux, H2O2 forme le radical hydroxyle extrêmement réactif (•OH) par la chimie de Fenton : •OH réagit de manière non spécifique et essentiellement instantanée avec toute biomolécule voisine (tableau 1)1,13. La disponibilité des ions de métaux de transition pour catalyser la chimie de Fenton est soigneusement contrôlée in vivo1, mais ceux-ci peuvent être libérés par une lésion tissulaire ou lorsque certaines protéines avec des clusters Fe–S rencontrent O2•− (réfs. 1,12,14). Leur importance in vivo a récemment été soulignée par la littérature croissante sur la ferroptose, une forme de mort cellulaire impliquant des ions fer « catalytiques »15. H2O2 est un substrat pour les peroxydases de l'hème telles que la myéloperoxydase, générant d'autres espèces réactives telles que HOCl (tableau 1). Malgré sa faible réactivité globale, H2O2 peut oxyder sélectivement certains résidus de méthionine (Met) et de cystéine (Cys)16,17 dans certaines protéines.

Une liste (loin d'être complète) des propriétés physicochimiques des ERO les plus courantes rencontrées en biologie est donnée dans le tableau 1, qui donne un aperçu des réactions qui pourraient être plausibles in vivo lorsque ces espèces sont générées. Ce qui devrait également être évident, c'est que «réactif» dépend fortement du contexte, car la réactivité des différents ERO varie à grande échelle, tout comme leur durée de vie, leur capacité à se diffuser et leur potentiel à générer d'autres espèces réactives en aval. En bref, tous les ROS ne sont pas identiques. La généralisation « ROS », bien que largement utilisée (y compris dans cet article !) ne donne pas d'informations sur l'espèce chimique réelle à l'origine de l'effet observé. Recommandation 1 : dans la mesure du possible, l'espèce chimique réelle impliquée dans un processus biologique doit être indiquée et il convient de déterminer si l'effet observé est compatible avec sa réactivité, sa durée de vie, les produits générés et son devenir in vivo. Si cela n'est pas possible, des mises en garde concernant l'utilisation du terme « ROS » doivent être discutées.

Une large gamme d'antioxydants est présente en biologie. Il s'agit notamment d'enzymes et de petites molécules qui réagissent avec les ERO individuels pour réduire les dommages oxydatifs et/ou moduler la signalisation redox1,2. Comme pour « ROS », l'utilisation d'« antioxydant » en tant que terme général peut être imprécise et trompeuse (encadré 1). Souvent, l'effet d'un antioxydant putatif sur un résultat biologique est utilisé pour déduire un rôle pour un ERO, comme si tous les antioxydants étaient équivalents. Cependant, chaque antioxydant a sa propre chimie et sa propre réactivité avec différents ROS. De plus, les principaux antioxydants in vivo sont des systèmes enzymatiques tels que la SOD pour O2•−, les peroxydases pour H2O2 et la séquestration des ions métalliques1,14. La plupart des composés de faible masse moléculaire couramment utilisés comme « antioxydants » sont des piégeurs stœchiométriques de certains ERO et ont souvent une réactivité modeste (voire nulle) avec O2•− ou H2O2. Par exemple, la N-acétylcystéine (NAC) est un « antioxydant » largement utilisé, mais elle a d'autres modes d'action (et parfois plus importants18). Le NAC peut en effet piéger certains ROS in vitro, mais pas d'autres, notamment pas H2O2 (réf. 18). Il peut également augmenter le pool de Cys cellulaire et ainsi augmenter les niveaux de glutathion (GSH), générer du H2S et cliver directement les disulfures de protéines18. Les composés de faible masse moléculaire qui agissent comme antioxydants in vivo comprennent la vitamine E, qui piège les radicaux peroxyl lipidiques19. Parfois, des « épurateurs de •OH » sont utilisés pour déduire un rôle pour ces ROS, mais ils peuvent rarement, voire jamais, atteindre une concentration suffisamment élevée pour empêcher la réaction instantanée efficace de •OH avec des biomolécules1,7,13. Par conséquent, bon nombre des effets biologiques attribués aux « antioxydants », en particulier la NAC, sont dus à d'autres effets. D'autres agents souvent utilisés comme « antioxydants », tels que le TEMPO/TEMPOL, le mito-TEMPO et les « mimétiques SOD » à base de porphyrine, subissent des réactions redox complexes in vivo et sont mieux décrits comme des « modulateurs redox » plutôt que comme des « antioxydants » ou « O2 •− charognards'1,20,21. Recommandation 2 : pour qu'une intervention soit attribuée à une activité antioxydante, l'espèce chimique particulière ciblée par « l'antioxydant » doit être précisée. Il faut reconnaître que les « antioxydants » de faible masse moléculaire sont peu susceptibles d'agir en éliminant le H2O2. La spécificité, la constante de vitesse, l'emplacement et la concentration de l'antioxydant dans la cellule devraient rendre un effet antioxydant chimiquement plausible. Dans la mesure du possible, l'activité de l'antioxydant doit être confirmée en mesurant une diminution des dommages oxydatifs.

Une procédure clé pour attribuer des dommages oxydatifs ou l'activation d'une voie de signalisation redox à un ROS particulier peut être la génération sélective du ROS dans un contexte biologique. Cela peut être fait en utilisant des composés à cycle redox tels que le paraquat (PQ) ou les quinones pour générer de l'O2•−, ou MitoPQ pour générer de l'O2•− dans les mitochondries1,22. Bien sûr, une génération accrue d'O2•− augmentera également la production de H2O2 par dismutation d'O2•−. La glucose oxydase peut être utilisée pour générer du H2O2 directement in vitro, tandis que la génération régulée de H2O2 dans les cellules peut être obtenue à l'aide de la d-aminoacide oxydase génétiquement exprimée, une enzyme qui génère du H2O2 lorsqu'elle oxyde les d-aminoacides23. Il peut être ciblé sur différents sites de la cellule et le flux régulé en faisant varier la concentration ajoutée de son substrat, la d-alanine23. Les enzymes NADPH oxydase (NOX) sont des sources importantes d'O2•− et de H2O2 pour la signalisation redox, ainsi que pour les dommages oxydatifs9,24, et la modulation de leur activité est une approche importante pour comprendre ces processus. Un certain nombre d'inhibiteurs assez spécifiques des enzymes NOX ont été décrits24. Cependant, l'utilisation de composés tels que l'apocynine et le diphénylèneiodonium comme « inhibiteurs de NOX » est encore largement répandue, même si leur manque de spécificité est bien établi1,24. Recommandation 3 : nous recommandons l'utilisation de PQ, de quinones et de MitoPQ pour la génération sélective d'O2•− et l'expression cellulaire de la d-aminoacide oxydase pour la génération contrôlée de H2O2. Éviter d'utiliser l'inhibition d'un phénomène par l'apocynine ou le diphénylèneiodonium comme seule preuve d'un rôle des enzymes NOX, ou au moins discuter de leur manque de spécificité. Des inhibiteurs spécifiques24 ou la suppression ou l'inactivation des composants NOX doivent être utilisés pour identifier leurs rôles.

Lors de l'étude des ROS dans les systèmes biologiques, il est important de détecter et de quantifier les ROS d'intérêt. Cela peut être fait en utilisant la résonance paramagnétique électronique (spin) (EPR/ESR), diverses molécules sondes ou en mesurant les modifications oxydatives (« dommages oxydatifs », Encadré 1) causées par le ROS1. La plupart des sondes ROS ne capturent qu'un petit pourcentage de tout ROS formé. En effet, si la sonde réagissait avec la plupart des ROS générés, cela perturberait le système et affecterait les résultats expérimentaux (par exemple, inhibition des dommages oxydatifs ou interférence avec la signalisation redox). Cependant, il est important que le pourcentage de capture reste approximativement constant sur différents taux de production du ROS en question.

Les dommages oxydatifs peuvent prendre plusieurs formes; les processus chimiques par lesquels il résulte d'un ERO particulier et la manière dont il est évalué et quantifié sont complexes. De plus, le niveau final de tout biomarqueur de dommage oxydatif mesuré est la différence entre son taux de production et son élimination par réparation, dégradation, excrétion ou diffusion. Recommandation 4 : lorsque les niveaux de dommages oxydatifs à une biomolécule sont présentés, les processus chimiques par lesquels ils surviennent et les méthodes utilisées pour les quantifier doivent être explicites. L'impact de la réparation et du dégagement sur les niveaux finaux mesurés doit être pris en compte et discuté.

La prise en compte des ROS, des antioxydants et des dommages oxydatifs comme des concepts monolithiques limite la précision et l'interprétation des expériences et passe sous silence la nécessité d'établir des mécanismes moléculaires précis. Pour mettre ces préceptes en pratique, il faut mesurer les produits spécifiques des ERO et/ou des dommages oxydatifs, ainsi que les effets des antioxydants. Il s'agit d'un défi pratique majeur, car la plupart des ROS ont une durée de vie courte (durée de vie de quelques millisecondes ou moins) et leurs niveaux à l'état d'équilibre sont faibles (picomolaires à micromolaires faibles) et s'altèrent rapidement, car ils sont affectés par des taux de génération continuellement variables, chimiques réaction et diffusion.

Dans des systèmes in vitro simples, il est possible de détecter plusieurs ROS (tableau 2). Par exemple, la production d'O2•− peut être contrôlée par la réduction du cytochrome c, et sa sélectivité évaluée par l'inhibition par la SOD ajoutée. Cependant, même un système aussi « simple » peut être étonnamment complexe. Par exemple, les semiquinones peuvent réduire le cytochrome c dans une réaction inhibée par la SOD25. L'essentiel est que toutes les méthodes utilisées pour évaluer les ROS sont sensibles aux artefacts, et des contrôles appropriés sont nécessaires pour être certains des espèces et des quantités mesurées. Par conséquent, il est important de corroborer les mesures avec des «techniques orthogonales» qui reposent sur une approche alternative utilisant une méthode de détection différente pour éviter les artefacts spécifiques à la méthode. Ces complexités sont amplifiées lorsque l'on tente de mesurer les ROS dans les cellules. Les conditions de culture cellulaire couramment utilisées favorisent les dommages oxydatifs dus à la fois aux antioxydants limités dans les concentrations moyennes et élevées d'O2 par rapport à celles in vivo26. Par conséquent, les cellules cultivées génèrent plus de ROS que ces cellules ne le feraient in vivo.

Recommandation 5 : utiliser des kits commerciaux uniquement si l'espèce réelle à mesurer et la méthode de détection sont expliquées dans les matériaux du kit, sont chimiquement plausibles et les limites sont comprises. L'utilisation de kits commerciaux sans ces informations est fortement déconseillée. Pour éviter les artefacts spécifiques à la méthode, confirmez les résultats à l'aide de techniques qui reposent sur différents principes de détection.

Les sondes fluorescentes à petites molécules sont fréquemment utilisées pour évaluer les ROS dans les cellules. Dans certains cas, impliquant souvent des kits, un manque de description de la réactivité chimique ou des structures de ces sondes rend difficile l'interprétation des résultats et, par conséquent, ces sondes doivent être évitées. Même pour les sondes de structure connue, il peut y avoir des problèmes. Considérez la sonde fluorescente largement utilisée 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH), généralement administrée sous sa forme diacétate (DCFH-DA), qui pénètre facilement dans les cellules. Le DCFH est oxydé en produit fluorescent 2',7'-dichlorofluorescéine (DCF) par plusieurs ROS, et il n'est donc pas spécifique d'un ROS particulier6,7. Le DCFH n'est pas oxydé directement par H2O2 (qu'on prétend souvent détecter), mais seulement après que H2O2 est converti en espèces plus réactives par des métaux redox-actifs ou par des protéines hémiques telles que le cytochrome c ou les peroxydases. En outre, l'oxydation du DCFH et la fluorescence du DCF sont sensibles aux niveaux locaux d'O2 et au pH, et le rendement de fluorescence peut ne pas être linéaire avec des niveaux accrus de ROS27,28,29. Cela ne veut pas dire que la DCFH et d'autres sondes fluorescentes non spécifiques telles que la dihydrorhodamine ne doivent jamais être utilisées, mais leurs limites (sélectivité, problèmes de quantification, linéarité de la réponse et sensibilité à l'artefact) doivent être comprises et les résultats interprétés avec prudence28. En particulier, leur réponse ne doit pas être attribuée à un ROS spécifique sans contrôles détaillés pour le valider, et leur utilisation doit être limitée à une évaluation initiale d'un changement d'état redox cellulaire, suivie d'une enquête plus détaillée sur le mécanisme. Alors que de nombreuses sondes fluorescentes à petites molécules et protéines sont plus sélectives que le DCF, il est toujours important de valider les données par un certain nombre de contrôles simples : la réponse change-t-elle avec le temps et avec la quantité d'échantillon biologique de manière plausible ? L'effet peut-il être reproduit en générant le ROS d'intérêt (par exemple, en utilisant PQ pour O2•− ou d-aminoacide oxydase pour H2O2) ? Les contrôles négatifs qui devraient abolir le processus de génération de ROS (par exemple, knockouts de gènes, knockdowns, inhibiteurs, piégeurs de radicaux) répondent-ils comme prévu ? Recommandation 6 : lors de l'utilisation de sondes ROS fluorescentes (en particulier DCFH-DA), la chimie impliquée, la sélectivité pour des espèces chimiques particulières et les artefacts potentiels doivent être clarifiés et discutés. Dans la mesure du possible, des contrôles pour montrer que la réponse est due à l'espèce proposée doivent être effectués et des techniques orthogonales utilisées pour corroborer la conclusion.

L'extension des mesures de ROS des cellules en culture aux tissus in vivo ou ex vivo est vitale. Cependant, dans certains cas, cette lacune a été comblée par l'ajout de «sondes ROS» à des tranches de tissus frais ou préalablement congelés ou à des homogénats ex vivo. Ces mesures peuvent être dénuées de sens, car la durée de vie très courte des ROS signifie que tout présent in vivo aura disparu depuis longtemps au moment où le matériau est dosé. De plus, la congélation ou l'homogénéisation perturbe les membranes et modifie les concentrations de substrat et d'ions (par exemple, en augmentant les niveaux de Ca2+ ou de Fe2+ « catalytique »)1, de sorte que toute production de ROS dans la tranche de tissu ou l'homogénat n'a aucun rapport avec les niveaux qui auraient été généré in vivo. Il existe des méthodes valides disponibles pour évaluer les ROS in vivo ou dans des organes perfusés, mais dans ces situations, le processus est soit surveillé in vivo (par exemple, voir le tableau 2 pour l'utilisation du composé catalase I pour mesurer H2O2) ou le système est désactivé pour stabiliser la sonde pour l'analyse ex vivo. Recommandation 7 : les mesures des ROS doivent être effectuées dans les cellules, les tissus ou les organes dans des conditions physiologiquement pertinentes in vivo ou ex vivo. Les ROS ne doivent pas être « mesurés » dans les homogénats de tissus ou les cryosections, à moins que la sonde ou le capteur utilisé ne soit capable de capturer de manière irréversible les espèces réactives lorsque les cellules/tissus/organes sont dans des conditions biologiquement pertinentes.

Nous décrivons ici ce que nous considérons être, actuellement, les meilleures approches pour la mesure des ROS couramment rencontrés.

Dans des systèmes simples, l'O2•− peut être mesuré de plusieurs manières, comme par la réduction du cytochrome c inhibant la SOD (réf. 25). La génération d'O2•− peut également être évaluée par piégeage de spin suivi d'une RPE, qui présente l'avantage d'une détection directe du radical1. Le cluster Fe–S dans l'aconitase est inactivé par O2•− et par d'autres ROS, mais son interaction avec O2•− est rapide, raisonnablement spécifique et réversible, ce qui en fait un bon indicateur de O2•− dans les mitochondries30. Le luminol et la lucigénine, les « sondes de superoxyde » chimioluminescentes, sont largement utilisés pour « détecter l'O2•− », mais l'interprétation de ces données est difficile car ces sondes génèrent des radicaux qui produisent eux-mêmes l'O2•− ; ils ne réagissent pas directement avec l'O2•−31,32.

Recommandation 8 : l'utilisation du luminol et de la lucigénine pour « détecter l'O2•− » devrait être déconseillée, mais ils peuvent être utilisés comme indicateurs généraux d'une production accrue de ROS. La réduction sensible à la SOD du cytochrome c in vitro et l'inactivation de l'aconitase dans les mitochondries sont de meilleures stratégies.

Dans les cellules, l'O2•− est souvent détecté en mesurant la fluorescence résultant de l'oxydation du dihydroéthidium (parfois appelé hydroéthidine (HE)) ou de l'HE ciblée sur les mitochondries (MitoSOX). Malheureusement, la détection par fluorescence est trompeuse car ces sondes forment à la fois l'éthidium (E+), un produit d'oxydation non spécifique, et le produit spécifique de l'O2•-, le 2-hydroxyéthidium. Étant donné que ces deux produits ont des spectres de fluorescence qui se chevauchent, il est difficile de différencier la contribution de l'oxydation non spécifique et de l'oxydation dépendante de l'O2•− (le cas échéant) à la fluorescence globale33. Une quantification précise du produit 2-hydroxyéthidium peut être obtenue en utilisant la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS)33. Un autre facteur qui doit être pris en compte est l'étendue de l'absorption cellulaire de HE/MitoSOX et les concentrations intracellulaires de ceux-ci et de leurs multiples produits. De plus, les produits d'oxydation HE s'intercalent dans l'ADN, améliorant considérablement leur fluorescence et créant un autre artefact. NeoD et MitoNeoD contiennent un HE modifié qui ne s'intercale pas dans l'ADN34.

Les sondes O2•−accumulées dans les mitochondries, telles que MitoSOX, sont souvent utilisées pour « détecter l'O2•− » dans les mitochondries. Lors de l'utilisation de ces sondes, et d'autres qui ont des charges positives ou génèrent des espèces chargées positivement (y compris le 2-hydroxyéthidium et l'éthidium), il est important de se rappeler que l'accumulation de sondes dépend des potentiels de membrane plasmatique et mitochondriale et de la taille, de la forme et de la masse des mitochondries35. De plus, la fluorescence peut être désactivée lorsque celles-ci sont présentes à des concentrations élevées dans les mitochondries36.

Recommandation 9 : n'utiliser que des sondes HE ou MitoSOX pour détecter l'O2•−par de simples mesures de fluorescence lorsque le produit a été validé indépendamment comme 2-hydroxyéthidium. Les mesures de fluorescence avec des sondes telles que le dihydroéthidium et MitoSOX33 doivent être effectuées en utilisant la concentration de sonde la plus faible possible, et doivent inclure des contrôles pour les changements dans les potentiels de membrane plasmatique et mitochondriale et la masse et la morphologie mitochondriales, telles que la normalisation à un potentiel de membrane similaire sensible, mais insensible au redox, sonde. Les méthodes LC-MS, qui mesurent toutes les espèces modifiées33, doivent être utilisées lorsque cela est possible.

Dans les systèmes simples, H2O2 peut être mesuré par des substrats oxydants à la peroxydase de raifort (HRP), l'un fréquemment utilisé étant l'Amplex Red. Ces méthodes peuvent être perturbées par d'autres substrats HRP (par exemple, ascorbate et NAC)1 et par O2•− (qui peut inactiver HRP), ce dernier pouvant être évité par l'ajout de SOD37. Étant donné que le H2O2 peut traverser les membranes directement ou via les aquaporines, ce système peut également être utilisé pour mesurer la libération de H2O2 des cellules. Cependant, sachez que cette libération reflète l'équilibre entre la production de H2O2, l'élimination par les enzymes intracellulaires et le taux de diffusion hors de la cellule.

Dans les cellules, la détection de H2O2 par des sondes à base de phénylboronate est plus fiable38 bien que celles-ci puissent manquer de sensibilité car elles ne réagissent que lentement avec H2O2, ce qui peut rendre difficile la détection de changements mineurs ou localisés dans les niveaux de H2O239. Cependant, des études récentes suggèrent que les acides boriniques, qui réagissent plus rapidement avec H2O2, pourraient être des détecteurs plus sensibles40. Le mécanisme d'oxydation des phénylboronates en phénols nécessite un oxydant à deux électrons, tel que H2O2. Étant donné que le H2O2 est généralement généré à des concentrations plus élevées que les autres ROS, les sondes de boronate peuvent être sélectives pour la détection de H2O2 sous réserve de contrôles appropriés39,40. Cependant, les sondes boronates réagissent beaucoup plus rapidement avec ONOO−/ONOOH ou HOCl qu'avec H2O2, ce qui peut parfois compliquer les mesures, et des approches orthogonales ou l'utilisation d'inhibiteurs peuvent aider à la validation41. Par exemple, les signaux dépendants de H2O2 et du peroxynitrite peuvent être distingués en utilisant des inhibiteurs de l'oxyde nitrique synthase (NOS) et de la catalase38,39,41,42.

Les capteurs de protéines fluorescentes codées génétiquement ont fourni des avancées majeures dans la détection cellulaire de H2O243,44,45,46. Ces sondes contiennent un commutateur dithiol qui modifie la fluorescence globale de la sonde en fonction de son état d'oxydation. Une sensibilité et une spécificité élevées pour H2O2 ont été obtenues en couplant un mutant de protéine fluorescente verte (GFP) sensible à l'oxydoréduction à une protéine thiol sensible à H2O2, telle que oxyR (série HyPer), ou à une peroxydase telle que Orp1 ou TSA2 (roGFP2- sondes basées). HyPer7 et roGFP2 couplés à une peroxirédoxine offrent la sensibilité la plus élevée44,45. Alors que les sondes basées sur HyPer7 et roGFP2 sont stables au pH, les versions antérieures de HyPer ne le sont pas et nécessitent l'expression d'une sonde de contrôle (SypHer) pour contrôler les changements de signal dus à la variation de pH43. L'analyse d'imagerie par microscopie à fluorescence est normalement utilisée, mais des lecteurs de plaques à fluorescence peuvent également être utilisés. L'état redox mesuré représente un équilibre entre le taux d'oxydation et de re-réduction des sondes par les réducteurs cellulaires, y compris la glutaredoxine/GSH et la thiorédoxine, permettant des évaluations en temps réel de l'état redox des cellules vivantes. Étant donné que les longueurs d'onde d'excitation des sondes réduites et oxydées sont utilisées, les sondes sont ratiométriques et la sortie ne dépend pas du niveau d'expression de la sonde protéique. En incorporant des séquences de gènes de ciblage appropriées, ces sondes peuvent être dirigées vers différents compartiments cellulaires, notamment les mitochondries, les microtubules, le réticulum endoplasmique, le noyau et le cytoplasme43,44,45,46. Par conséquent, les régions subcellulaires d'intérêt peuvent être étudiées et la sonde ensuite calibrée à la fin par réduction complète (dithiothréitol 2 mM), lavage et oxydation complète (hydroperoxyde de t-butyle 2 mM)44,45. Cet étalonnage donne une mesure du pourcentage d'oxydation, permettant des comparaisons entre les expériences et entre les compartiments subcellulaires44,45. Ces sondes ont été exprimées chez des animaux transgéniques pour fournir des évaluations utiles des générations de H2O2 in vivo46,47. La transfection plasmidique de vecteurs viraux peut être utilisée avec des cellules en culture, et des sondes roGFP2 ciblées sont disponibles dans le commerce (www.addgene.com).

Dans la plupart des expériences, les sondes H2O2 sont exprimées sous forme de protéines libres qui se répartissent dans la cellule. Néanmoins, compte tenu des incertitudes sur les distances de diffusion intracellulaire de H2O2, on ne sait toujours pas quelle résolution est nécessaire pour comprendre la distribution subcellulaire de H2O2. Par conséquent, attacher des sondes H2O2 à des emplacements sous-compartimentaux tels que des complexes protéiques ou des sites de contact avec des organites est une approche importante.

Recommandation 10 : les sondes fluorescentes codées génétiquement (dont certaines sont disponibles dans le commerce) sont actuellement les détecteurs les plus sensibles de H2O2 et nous recommandons leur utilisation dans les cellules et les animaux si l'expression est possible. Les sondes de boronate (dont certaines sont également disponibles dans le commerce) sont les sondes à petites molécules préférées, mais des contrôles pour déterminer la spécificité pour H2O2 sont nécessaires et la sensibilité est limitée pour les niveaux physiologiques de H2O2. Amplex Red avec HRP peut mesurer la libération de H2O2 par les cellules si d'autres agents réducteurs ou substrats de peroxydase sont absents.

Le peroxynitrite (ONOO−) présente une chimie complexe42,48,49 et peut lui-même oxyder certaines biomolécules. Une réaction physiologique majeure est avec le CO2 (tableau 1), et donc la teneur en CO2/ \({{{\mathrm{HCO}}}}_3^{- }\) des systèmes biologiques joue un rôle dans la détermination de l'impact biologique50 d'ONOO−. Les produits de cette réaction comprennent des espèces réactives telles que l'anion radicalaire carbonate (CO3•−) et l'agent nitrant dioxyde d'azote (NO2•) (tableau 1), qui réagissent tous deux avec de nombreuses « sondes ROS » générales. Le peroxynitrite oxyde les sondes à base de boronate près d'un million de fois plus rapidement que H2O2 et, dans les bonnes conditions, ces sondes peuvent être utilisées pour évaluer la production d'ONOO−/ONOOH42,49. Le peroxynitrite a été dosé dans les tissus ex vivo à l'aide de sondes de boronate51.

HOCl, l'acide hypobromeux (HOBr) et certaines des chloramines et bromamines qui en sont dérivées (tableau 1) réagissent avec la plupart des sondes générales utilisées pour détecter les ROS, y compris le DCFH et le luminol. Cependant, bon nombre de ces sondes sont également des substrats des peroxydases qui génèrent du HOCl ou du HOBr, ce qui complique leur utilisation. Des sondes fluorescentes plus spécifiques pour les espèces halogénées réactives ont été signalées et certaines sont disponibles dans le commerce52. Une sonde génétiquement codée pour les espèces halogénées réactives a été développée, permettant un suivi dynamique de ces espèces à la fois en culture cellulaire et in vivo53.

La présence de ROS peut être déduite par leurs effets sur les protéines, les glucides, les acides nucléiques et les lipides pour générer des composés spécifiques qui, tant qu'ils ne peuvent pas être formés par d'autres mécanismes, peuvent être utilisés comme "biomarqueurs" des dommages oxydatifs (Encadré 1) 1,54,55. Cependant, notez que les niveaux mesurés de biomarqueurs représentent un équilibre entre la génération et l'élimination du biomarqueur (par exemple, par dégradation, diffusion ou excrétion), ainsi que toute augmentation artéfactuelle causée par des dommages oxydatifs lors de l'isolement ou de l'analyse.

Les acides gras polyinsaturés (AGPI) sont facilement oxydés et, par conséquent, les produits de peroxydation lipidique sont largement utilisés pour caractériser les dommages oxydatifs56,57,58. La peroxydation lipidique peut être initiée par certains ROS et se dérouler comme un processus radicalaire aléatoire et non enzymatique (souvent en chaîne). Cependant, il existe également des mécanismes enzymatiques (par exemple, les lipoxygénases) disponibles pour la peroxydation des AGPI libres ou des AGPI-phospholipides qui produisent des produits de signalisation spécifiques ayant des rôles biologiques. Ainsi, lors de la mesure de la peroxydation lipidique, l'accent peut être mis sur (1) l'établissement d'une peroxydation lipidique accrue comme exemple de dommage oxydatif ou (2) l'identification de molécules lipidiques individuelles modifiées par oxydation agissant comme des signaux par interaction sélective avec certaines cibles cellulaires.

Dans les PUFA, la présence d'une double liaison adjacente à un groupe méthylène rend la liaison méthylène C–H plus faible et, par conséquent, l'hydrogène bis-allylique est plus sensible à l'abstraction de H•56,57,58. Le radical carboné (L) généré par abstraction de H• est stabilisé par délocalisation sur les doubles liaisons. La réaction ultérieure avec O2 donne un radical peroxyle (LOO) avec formation d'un système diène conjugué et d'une gamme de peroxydes (LOOH). LOO• peut réagir davantage pour produire des produits secondaires fortement oxydés, notamment des peroxydes époxy, oxo ou cycliques56,57,58. Par conséquent, il existe de multiples produits finaux de peroxydation lipidique qui présentent une grande hétérogénéité chimique et une stabilité et une polarité variables, et donc la mesure d'un seul produit d'oxydation ne représente en aucun cas l'ensemble du processus de peroxydation lipidique.

Plusieurs méthodes sont disponibles pour évaluer la peroxydation lipidique « générale ». Dans des systèmes modèles simples (par exemple, des lipoprotéines isolées), la conjugaison du diène peut être mesurée par l'absorbance ultraviolette (UV), mais cette méthode n'est pas adaptée à une utilisation dans des cellules ou des fluides corporels en raison de la présence de molécules interférentes absorbant les UV qui ne résultent pas de la peroxydation lipidique1. Dans les cellules, la « peroxydation lipidique » peut être évaluée par des changements dans la fluorescence de BODIPY conjugué à une fraction d'acide undécanoïque sensible à la peroxydation59. Ce test est techniquement simple mais doit être interprété avec prudence car le taux de réaction de BODIPY avec les radicaux peroxyles est plus lent que celui des antioxydants piégeant les radicaux, et donc la suppression de la fluorescence BODIPY par les antioxydants ne doit pas toujours refléter leur capacité à supprimer la peroxydation lipidique59. Un autre dosage fluorométrique de la peroxydation lipidique utilise l'acide cis-parinarique (PnA), un acide gras à quatre doubles liaisons conjuguées. L'oxydation de PnA perturbe son système conjugué et donc sa fluorescence. Étant donné que le PnA peut être incorporé dans différentes classes de phospholipides, la séparation par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) fournit des informations sur l'oxydation de différents phospholipides60. Cependant, l'extrapolation des résultats basés sur le PnA à l'oxydation endogène des phospholipides est difficile en raison du taux d'oxydation plus élevé du PnA, de sa vulnérabilité au photoblanchiment et de l'incorporation métabolique variable du PnA dans différents phospholipides60.

La peroxydation lipidique est fréquemment évaluée par la mesure de produits finaux tels que les hydroxyalcénals α,β-insaturés61, idéalement par des techniques basées sur la SM. En particulier, la formation de 4-hydroxynonénal (HNE) a été largement utilisée. Les anticorps dirigés contre les adduits protéiques formés par le HNE sont largement disponibles et fréquemment utilisés dans l'immunocoloration des tissus, mais il faut savoir que différents anticorps peuvent détecter différents épitopes et donc donner des réponses différentes, selon les résidus d'acides aminés auxquels le HNE se lie dans les protéines61, 62,63,64.

Un produit final mineur de la peroxydation lipidique est le malondialdéhyde (MDA)61, qui peut également être un biomarqueur utile s'il est mesuré par des techniques MS. Cependant, les « dosages MDA » largement utilisés utilisant des substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS) ne sont pas spécifiques puisque le TBA génère des chromogènes à partir de nombreuses biomolécules autres que le MDA1,65. L'utilisation de la HPLC pour séparer le "vrai" adduit TBA–MDA des faux chromogènes augmente la spécificité mais n'élimine pas tous les problèmes1.

Recommandation 11 : l'application du test TBA simple (TBARS), ou des kits basés sur son utilisation, aux cellules, tissus ou fluides corporels n'est pas recommandée comme seul test utilisé pour l'évaluation des dommages lipidiques oxydatifs en raison de la faible spécificité qui peut résultats faussement positifs. Les tests TBA basés sur HPLC sont moins sujets aux artéfacts.

La détection des produits d'oxydation des lipides a été révolutionnée par le développement de la LC-MS pour l'analyse détaillée des mélanges de lipides oxydés66. La collecte et le stockage des échantillons pour éviter la peroxydation artificielle sont essentiels à toute étude de peroxydation lipidique, et les échantillons pour une analyse ultérieure doivent être immédiatement congelés dans de l'azote liquide. Les biofluides peuvent nécessiter l'ajout de produits chimiques (par exemple, l'hydroxytoluène butylé) pour empêcher l'auto-oxydation pendant le stockage1,67. Les étalons internes utilisés pour la quantification doivent être ajoutés aux échantillons avant l'extraction par solvant. Ces méthodes basées sur LC-MS présentent les avantages d'une sensibilité élevée, d'un faible volume d'échantillon requis et de la capacité de détecter plusieurs produits finaux de la peroxydation lipidique. Cela fait des protocoles LC-MS les méthodes de choix pour l'évaluation de la peroxydation lipidique générale et l'identification de produits individuels, y compris ceux ayant des fonctions de signalisation spécifiques. Cependant, les limites des normes disponibles peuvent parfois empêcher l'analyse quantitative de certains produits. Une attention scrupuleuse à la méthodologie est requise dans de telles études68.

Parmi les produits d'oxydation des lipides qui ont été quantifiés par des approches basées sur la SEP, les F2-isoprostanes (F2-IsoPs)69 sont les plus importants. Soixante-quatre stéréoisomères F2-IsoP peuvent être générés à partir de l'oxydation non enzymatique induite par les radicaux libres de l'acide arachidonique et peuvent être séparés de ceux qui résultent de l'oxydation enzymatique de l'acide arachidonique par les enzymes cyclo-oxygénases (COX-1/ -2). Les isoprostanes F3 et F4 proviennent respectivement de l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et de l'acide docosahexaénoïque (DHA), mais ont été moins bien caractérisés que les isoprostanes F2. Des méthodes ELISA ont été développées pour quantifier un isomère F2-IsoP, 8-iso-PGF2α (également appelé 15-F2t-IsoP ou iPF2α-III), et comparées à la chromatographie en phase gazeuse–MS et LC–tandem MS (LC–MS /MS) méthodes69,70,71,72,73. Dans toutes ces études, il y avait un faible accord entre les kits ELISA disponibles dans le commerce et les méthodes MS ; La 8-iso-PGF2α est l'un des 64 isomères F2-IsoP différents générés lors de la peroxydation de l'acide arachidonique, et la réactivité croisée des anticorps entre la 8-iso-PGF2α et les isomères apparentés est difficile. Le nettoyage de l'échantillon avant l'analyse peut permettre une mesure plus précise de la 8-iso-PGF2α par ELISA72,73, mais la méthode de loin la plus précise pour la quantification des F2-IsoP est la LC-MS/MS et est très fortement recommandée.

Recommandation 12 : Les F2-IsoP sont un biomarqueur généralement accepté de la peroxydation des lipides, mais il faut savoir qu'ils sont l'un des nombreux produits finaux et que les niveaux de divers types peuvent être affectés par les conditions expérimentales69. La quantification par ELISA est sensible aux artefacts, mais le nettoyage de l'échantillon peut permettre la mesure de la 8-iso-PGF2α par ELISA73. La LC–MS/MS avec des étalons internes appropriés est l'approche privilégiée.

Les résidus d'acides aminés dans les protéines sont sensibles à la modification oxydative, dont certaines formes fournissent des biomarqueurs utiles74,75. Des protocoles détaillés pour la mesure de plusieurs produits peuvent être trouvés dans les réf. 76,77. Une modification protéique courante est la formation de «protéines carbonyles» due à l'oxydation de résidus d'acides aminés spécifiques en produits porteurs de groupes carbonyle; les carbonyles peuvent également être formés par la réaction d'aldéhydes avec des sites nucléophiles sur des protéines ou par glycation75,77. De nombreux tests impliquent la dérivation du groupe carbonyle avec la 2,4-dinitrophénylhydrazine pour former une dinitrophénylhydrazone (DNP). Ce produit peut être détecté par spectrophotométrie, bien que cette approche puisse souffrir d'un bruit de fond élevé et d'une faible reproductibilité ; pour contourner cela, les adduits DNP peuvent être séparés par LC avant la mesure. Alternativement, les carbonyles peuvent être détectés à l'aide d'un anticorps contre les produits DNP par ELISA ou immunotransfert78. Les changements dans les protéines carbonyles peuvent être mesurés dans des homogénats de tissus traités avec de la fluorescéine-5-thiosemicarbazide (FTC) pour générer des protéines marquées par un fluorophore qui peuvent être séparées par électrophorèse sur gel79. Des méthodes d'enrichissement utilisant la dérivatisation marquée à la biotine couplée à la détection LC-MS ont été développées80. Les carbonyles protéiques, le semialdéhyde α-aminoadipique et le semialdéhyde glutamique ont également été dosés individuellement par analyse de dilution isotopique stable LC–MS/MS77. Bien sûr, les données d'un seul point dans le temps reflètent la différence entre les taux de formation et d'élimination (par exemple, par réparation ou protéolyse) de ces produits.

L'analyse des protéines par MS permet la détection et l'identification des modifications avec des augmentations de masse caractéristiques (par exemple, l'hydroxylation, la nitration et la chloration)75,76. Cela a été particulièrement utile dans les études sur les dommages oxydatifs aux protéines cérébrales chez les patients atteints de démence par la « protéomique redox »81. La cartographie au niveau peptidique après clivage protéolytique permet la détection de la nature de la modification, sa localisation dans la séquence protéique et la perte concomitante du peptide parent, permettant une quantification relative. L'analyse des acides aminés après digestion complète permet de déterminer les types et les concentrations absolues d'espèces particulières (déterminées par l'utilisation d'étalons marqués par des isotopes) ainsi que l'espèce parente, permettant la détermination d'un «bilan de masse»75,76,77,82. Des précautions doivent être prises lors de la manipulation des échantillons pour éviter l'oxydation artificielle de Cys ou de Met, ainsi que pendant l'hydrolyse des protéines, car certains produits de dommages oxydatifs aux protéines sont labiles. Les analyses LC-MS présentent de nombreux avantages, notamment une spécificité élevée, une sensibilité élevée, la capacité de détecter simultanément de nombreuses modifications et espèces parentes différentes, ainsi que la capacité de détecter des produits diagnostiques des ERO impliqués, tels que la chloration de HOCl83 et des espèces nitrées. résultant de l'action de la myéloperoxydase en présence de NO2− et/ou par des réactions de ONOO−/ONOOH49,84). Ces approches LC-MS peuvent être réalisées sur des matériaux allant des protéines isolées aux échantillons de tissus. La quantification par rapport aux acides aminés ou aux peptides non modifiés, et de préférence par rapport aux matériaux ajoutés marqués par des isotopes lourds, est recommandée pour surmonter les artefacts potentiels résultant de la manipulation et de la préparation des échantillons. Cependant, gardez à l'esprit que les niveaux plasmatiques et urinaires d'acides aminés oxydés peuvent avoir des contributions provenant de l'absorption d'acides aminés oxydés à partir de protéines dans les aliments ou d'une protéolyse tissulaire accrue à la suite d'une pathologie. Ni l'un ni l'autre n'ont encore été étudiés en détail.

La cystéine est une cible majeure de modification en raison de sa facilité d'oxydation (en particulier sous sa forme thiolate, RS−) et de sa nucléophilie, qui se traduit par la formation d'adduits faciles avec les électrophiles. L'oxydation peut être irréversible, par exemple en un acide sulfinique ou sulfonique, qui peuvent être des biomarqueurs utiles des dommages oxydatifs aux protéines4,85. L'oxydation réversible des résidus Cys dans les protéines est un mécanisme important de la signalisation redox2,4. Les produits réversibles comprennent les disulfures, les acides sulféniques, le S-nitrosothiol et les espèces persulfures2,4,85,86,87. Ces modifications peuvent être inversées par les systèmes GSH/glutaredoxine ou thioredoxine87. Une approche courante dans la détection du pool de résidus Cys modifiés de manière réversible consiste à bloquer d'abord les thiols réduits avec un réactif, puis à réduire et à dérivatiser les résidus précédemment oxydés avec une étiquette qui peut être identifiée par LC-MS de digestions tryptiques88. Ces approches peuvent être étendues à l'utilisation de la chimie spécifique à la modification pour ne marquer qu'un produit d'oxydation particulier, tel qu'un S-nitrosothiol, un acide sulphénique ou un persulfure88. Jusqu'à récemment, les principales limites de ces approches étaient la faible couverture du pool total de Cys et le manque de quantification de la modification au niveau des résidus individuels87,88,89. Ce dernier est d'une importance particulière lors de l'interprétation de l'importance biologique des modifications réversibles. Des améliorations substantielles de la quantification ont été obtenues par marquage isobare, dans lequel les résidus Cys réduits sont d'abord marqués avec une étiquette, les résidus modifiés de manière réversible sont réduits, puis marqués avec une étiquette chimiquement identique, mais modifiée par isotope lourd, qui permet la quantification de la proportion oxydé pour chaque Cys particulier. Ces méthodes ont été étendues aux étiquettes qui incorporent des fragments tels que la biotine, qui permettent l'enrichissement des peptides marqués, améliorant considérablement la couverture de Cys. L'itération la plus récente de cette approche, illustrée par l'étude OxiMOUSe89, a remplacé les méthodes précédentes.

La méthionine est également un site majeur de modifications redox post-traductionnelles. L'oxydation en méthionine sulfoxyde peut être inversée par voie enzymatique par les enzymes méthionine sulfoxyde réductase, facilitant potentiellement la signalisation redox par l'installation/le retrait d'un seul atome d'oxygène17. Des réactifs ont été développés pour la bioconjugaison de la méthionine qui peuvent identifier et caractériser les sites de méthionine sensibles à l'oxydoréduction dans les protéomes90.

Recommandation 13 : L'ELISA, la FTC et l'immunotransfert sont des outils utiles pour la détection des protéines carbonyles en tant que biomarqueur des dommages oxydatifs généraux des protéines, bien qu'il faille se rendre compte que tous les produits d'oxydation des protéines ne contiennent pas de carbonyles. Les approches LC-MS, utilisant des échantillons soigneusement préparés, sont les meilleures techniques disponibles pour l'évaluation de l'oxydation des protéines en raison de la sensibilité, de la sélectivité et de la quantification disponibles avec ces méthodes. L'utilisation d'approches orthogonales, telles que des anticorps spécifiques et validés (voir ci-dessous) contre des produits d'oxydation individuels, est également encouragée.

Les modifications oxydatives de l'ADN et de l'ARN sont souvent utilisées comme biomarqueurs des dommages oxydatifs1,13,91. Une méthode utilisée pour évaluer les dommages oxydatifs «généraux» de l'ADN dans les cellules est le test des comètes, qui détecte les ruptures de brins d'ADN. De telles cassures peuvent survenir par plusieurs mécanismes, pas nécessairement via des dommages oxydatifs, mais l'utilisation d'enzymes de réparation qui "coupent" l'ADN aux sites d'oxydation augmente la spécificité des dommages oxydatifs à l'ADN. La mesure la plus simple est la longueur du «fantôme» d'ADN après électrophorèse de cellules incluses dans un gel sur une lame de microscope92.

Les dommages oxydatifs à l'ADN se concentrent généralement sur l'oxydation de la guanine en 8-oxo-7,8-dihydro-2′-désoxyguanosine (8OHdG ou 8-oxodG). Les données sur les modifications à d'autres bases sont limitées, même si celles-ci sont susceptibles d'être biologiquement importantes1,13. Ces mesures nécessitent l'isolement de l'ADN et sa digestion pour libérer les bases modifiées, et il peut y avoir une fausse oxydation lors de la manipulation et de l'analyse des échantillons. Des initiatives multi-laboratoires93 ont établi des protocoles pour éviter cela et ont déterminé des niveaux « normaux » de 8OHdG. La quantité de 8OHdG (ou de tout autre produit de dommages oxydatifs à l'ADN) mesurée dans l'ADN est l'équilibre entre le taux d'oxydation et celui de réparation. La meilleure méthodologie est la LC–MS/MS ultra performante (UPLC–MS/MS)94. Il faut être prudent dans l'utilisation des méthodes ELISA, qui manquent de sensibilité et de spécificité et peuvent donner des résultats variables entre les lots, et il y a parfois une réaction croisée entre la 8-hydroxyguanosine (8OHG) et la 8OHdG. Cependant, l'immunohistochimie peut être utile dans l'identification des cellules qui ont des quantités plus élevées de 8-OHdG in vivo, si elles sont appliquées de manière appropriée95.

Les nucléosides oxydés de l'ADN et de l'ARN peuvent être détectés dans divers fluides corporels. À l'origine, on pensait qu'ils provenaient de la réparation de l'ADN, en particulier de la réparation par excision de nucléotides. Cependant, ils proviennent également de l'oxydation des pools de précurseurs de nucléotides d'ADN et d'ARN « aseptisés » par élimination des produits oxydés94. Les contributions relatives de la réparation de l'ADN et de la désinfection du pool de nucléotides aux niveaux de nucléosides oxydés détectés dans les fluides corporels ne sont actuellement pas claires. L'urine recueillie sur 24 h représentera le nombre de guanines dans l'ADN/ARN et/ou les pools de précurseurs de nucléotides respectifs oxydés au cours de cette période96. L'échantillonnage d'urine représente la formation dans tout le corps et convient mieux aux situations où tous les tissus sont supposés être affectés, mais il pourrait être inadéquat pour détecter les changements qui ne se produisent que dans certains organes. La mesure dans des tissus spécifiques sera un instantané de l'équilibre entre la génération et la réparation, et peut ne pas représenter les processus dans d'autres organes.

Recommandation 14 : lors de la mesure des modifications oxydatives d'acides nucléiques à partir d'échantillons de cellules ou de tissus extraits, il faut faire très attention à éviter toute oxydation parasite dans les étapes de préparation et d'analyse. Les méthodes telles que le test des comètes (utilisant des enzymes de réparation de l'ADN) sur des cellules isolées et l'UPLC-MS/MS pour la détermination de 8OHdG et 8OHG dans les fluides corporels ou les acides nucléiques extraits des tissus sont actuellement les meilleures disponibles. Les méthodes basées sur ELISA, en particulier sous forme de kit, sont généralement insuffisamment validées et leur utilisation n'est pas recommandée.

Comme discuté ci-dessus, les anticorps ont été largement utilisés pour détecter les produits d'oxydation (et également les adduits) formés sur les protéines (par exemple, les carbonyles et la 3-nitro- et 3-chlorotyrosine), l'ADN (par exemple, le 8-oxodG) et les lipides (F2 -Isoprostanes). Ils ont été utilisés, par exemple, dans les formats ELISA, immunohistochimie et précipitation immunitaire, mais souffrent souvent d'une réactivité de fond, d'une réactivité croisée et d'un manque de spécificité. Pour résoudre ce problème, l'épitope utilisé pour générer l'anticorps doit être documenté (par exemple, comme pour HNE)62,63,64 et des contrôles pour éliminer le bruit de fond doivent être inclus. Le blocage par des échantillons authentiques de l'épitope est recommandé pour déterminer la sélectivité. La quantification relative est possible, mais la quantification absolue peut être difficile, par exemple en raison d'une mauvaise accessibilité aux épitopes (par exemple, dans les protéines, le produit d'oxydation peut être enterré). De plus, des anticorps sont généralement générés contre des peptides non structurés chimiquement modifiés et le ou les épitopes reconnus peuvent ne pas toujours avoir été déterminés.

Recommandation 15 : des anticorps bien validés contre des produits spécifiques sont des outils de détection utiles lorsqu'ils sont utilisés avec des précautions et des contrôles appropriés, y compris ceux pour les interactions non spécifiques. Les données de compétition avec des épitopes authentiques doivent être incluses dans la mesure du possible.

La mesure des ROS in vivo est un défi. Des méthodes de REP ont été développées mais ne sont pas encore largement utilisées. Les approches bioluminescentes de la détection des ROS comprennent la luciférine-1 en cage peroxy qui, lors de l'oxydation, forme la luciférine in situ qui est oxydée dans les systèmes transfectés par la luciférase pour générer la bioluminescence97. Comme indiqué précédemment, des biocapteurs redox codés génétiquement ont été utilisés dans des études animales. Avec le développement d'une sensibilité et de modalités de détection améliorées, la tomographie par émission de positrons est maintenant utilisée pour imager les ROS in vivo98 mais en est encore à ses balbutiements. Dans les mitochondries des cellules et des tissus, les changements de H2O2 peuvent être évalués à l'aide du boronate MitoB ciblé sur les mitochondries, qui s'accumule dans ces organites et est converti par H2O2 en MitoP. Le rapport de MitoP à MitoB peut ensuite être déterminé par MS99.

Parce que les dommages oxydatifs jouent un rôle central dans de nombreuses pathologies humaines, il existe un intérêt considérable à développer des interventions thérapeutiques pour diminuer ces dommages1,2,3. Un corollaire est que dans les essais cliniques, nous devrions être en mesure de démontrer comment ces interventions affectent les dommages oxydatifs. Par exemple, de nombreux essais cliniques randomisés en double aveugle ont été menés avec des « antioxydants » tels que le bêta-carotène, la vitamine C et la vitamine E. Ceux-ci n'ont généralement pas réussi à influencer l'activité de la maladie. Malheureusement, dans la plupart des cas, l'effet de l'intervention sur les dommages oxydatifs n'a pas été mesuré, ce qui rend incertain si la thérapie putative était réellement efficace pour réduire les dommages oxydatifs : si ce n'était pas le cas, l'absence d'effet est prévisible1,55.

Pour résoudre ce problème, il est essentiel d'évaluer l'impact de ces interventions sur les niveaux de dommages oxydatifs chez les patients dans les essais cliniques. Actuellement, les méthodes se limitent à mesurer les points finaux des dommages oxydatifs dans les biopsies (par exemple, la peau ou les muscles) ou les fluides corporels cliniquement accessibles tels que le plasma, la salive, les expectorations ou l'urine, et parfois le liquide céphalo-rachidien. Ces biomarqueurs ont inclus ceux de l'oxydation des acides nucléiques tels que 8OHG et 8OHdG100 et F2-isoprostanes comme biomarqueur de la peroxydation lipidique69,101. À ce jour, une utilisation limitée a été faite des biomarqueurs de l'oxydation des protéines dans les essais cliniques. Cependant, il existe des preuves de fortes associations d'altérations des rapports protéiques thiol/disulfure, et d'une augmentation des carbonyles protéiques et d'autres modifications avec des pathologies75,76,77.

Plus généralement, les essais cliniques doivent inclure des biomarqueurs validés internationalement : le biomarqueur doit idéalement avoir fait l'objet d'une comparaison interlaboratoire. De nombreux biomarqueurs reposent sur la mesure de la concentration dans les fluides corporels tels que le plasma, mais ceux-ci ne reflètent que l'équilibre entre les taux de formation et d'élimination et ne peuvent donc pas être facilement interprétés comme un «stress oxydatif». Cependant, des modèles ont été développés pour estimer la production sur 24h de certains biomarqueurs100. Idéalement, un panel de biomarqueurs devrait être utilisé54,55 car les produits finaux des dommages oxydatifs aux lipides, aux protéines et aux acides nucléiques ne sont pas nécessairement corrélés les uns aux autres, et nous ne nous attendons pas non plus à ce qu'ils le soient car ce sont des cibles moléculaires différentes de différents ROS.

Recommandation 16 : en cas d'intervention avec des antioxydants, utiliser d'abord des biomarqueurs dans des études préliminaires de dosage pour déterminer si l'intervention diminue effectivement les dommages oxydatifs aux biomolécules concernées. Ils doivent inclure des biomarqueurs bien définis analysés avec une méthodologie validée et/ou des approches orthogonales. Nous ne recommandons pas dans les études cliniques (ou autres !) L'utilisation du test d-ROMS (pour des raisons expliquées dans la réf. 1), TBARS, les déterminations de l'activité antioxydante totale1,102 ou les méthodes basées sur le kit lorsque la méthodologie derrière le kit n'est pas clair et/ou n'a pas été validé.

L'objectif de cette déclaration de consensus est de générer une ressource utile pour les chercheurs de divers domaines qui ont besoin de mesurer les ROS et d'évaluer les événements oxydatifs pour étudier leur importance biologique. Nous avons discuté des limites de nombreuses procédures actuellement utilisées et suggéré les meilleures approches actuellement disponibles. Inévitablement, de nouvelles techniques seront développées et appliquées à l'avenir, mais les principes de notre philosophie prudente, illustrés par nos 16 recommandations (résumées dans la Fig. 1), resteront valables.

Ici, nous avons résumé et abrégé les recommandations de meilleures pratiques développées dans ce manuscrit.

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Nous nous excusons auprès de nos collègues pour les nombreux articles clés que nous n'avons pas pu citer en raison du manque d'espace, combiné à l'étendue de la couverture requise dans une déclaration de consensus. Nous remercions AJ Kowaltowski pour ses commentaires utiles sur le manuscrit. Le travail dans le laboratoire de MPM est soutenu par une subvention du Medical Research Council UK (n° MC_UU_00015/3) et par une bourse Wellcome Trust Investigator (n° 220257/Z/20/Z). Les travaux dans les laboratoires de HB et VEK sont soutenus par les National Institutes of Health (NIH), États-Unis (numéros de subvention AI145406, CA165065, CA266342, HL114453, AI156924, NS076511, AI156923, NS061817 et NS117000). KJAD a été soutenu par la subvention no. ES003598 de l'Institut national des sciences de la santé environnementale des NIH des États-Unis, et par la subvention no. AG052374 du National Institute on Aging du NIH américain. RR a été soutenu par des subventions de l'Universidad de la República, Uruguay (nos. CSIC_2018 et EI_2020). La recherche dans le laboratoire de BH est soutenue par des subventions du Conseil national de la recherche médicale de Singapour, de l'Université nationale de Singapour, de la Fondation nationale de recherche de Singapour et de la Fondation Tan Chin Tuan. CJC est soutenu par le NIH (nos. GM 79465, GM 139245 et ES 28096) et est boursier CIFAR. Le travail dans le laboratoire de ST est soutenu par JST CREST (subvention n° JPMJCR19H4), JSPS Kakenhi (subvention n° JP16H06276[AdAMS], JP19H05462 et JP20H05502) et une bourse de recherche du Princess Takamatsu Cancer Research Fund (n° 19-25126 ). Les travaux dans le laboratoire de TPD sont soutenus par des subventions du Conseil allemand de la recherche (n° DFG, TRR184 et SPP2306) et du Conseil européen de la recherche (n° 742039). Les travaux dans le laboratoire de HY sont soutenus par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (nos. 32030053 et 32150710522). Les travaux dans le laboratoire de MJD sont soutenus par la Fondation Novo Nordisk (subventions n° NNF13OC0004294, NNF19OC0058493 et ​​NNF20SA0064214). Les travaux dans le laboratoire de N.-GL sont soutenus par le Conseil suédois de la recherche (2015-00418), la Fondation suédoise du cancer, la fondation Knut et Alice Wallenberg, le Conseil européen de la recherche (Advanced Grant 2016-741366) et la Fondation Novo Nordisk. BH est reconnaissant à Alvin Loo d'avoir soulevé la question des kits douteux pour mesurer le ROS.

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L'impulsion initiale pour cette déclaration de consensus est venue de BH et MPM, qui ont rédigé les versions initiale et finale. HB, VB, CJC, KJAD, MJD, TPD, TF, HJF, YJ-H., DG, VEK, BK, N.-GL, GLM, TN, HEP, RR, HVR, PTS, PJT, ST, CCW et HY a écrit des parties du manuscrit et a édité et approuvé l'ensemble du manuscrit.

Correspondance à Michael P. Murphy ou Barry Halliwell.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Metabolism remercie Liron Bar-Peled, Kathy Griendling et Pietro Ghezzi pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la manipulation primaire : Christoph Schmitt, en collaboration avec l'équipe de Nature Metabolism.

Réimpressions et autorisations

Murphy, MP, Bayir, H., Belousov, V. et al. Lignes directrices pour mesurer les espèces réactives de l'oxygène et les dommages oxydatifs dans les cellules et in vivo. Nat Metab 4, 651–662 (2022). https://doi.org/10.1038/s42255-022-00591-z

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Reçu : 14 janvier 2022

Accepté : 19 mai 2022

Publié: 27 juin 2022

Date d'émission : juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42255-022-00591-z

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