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Jun 15, 2023

Comparaison des électrodes fractales et grilles pour étudier les effets du confinement spatial sur le comportement neuronal et glial rétinien dissocié

Rapports scientifiques volume 12,

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 17513 (2022) Citer cet article

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Comprendre l'impact de la géométrie et de la composition matérielle des électrodes sur la survie et le comportement des cellules rétiniennes est important pour les études cellulaires fondamentales et les applications de neuromodulation. Nous étudions comment les cellules rétiniennes dissociées de souris C57BL/6J interagissent avec des électrodes constituées de nanotubes de carbone alignés verticalement cultivés sur des substrats de dioxyde de silicium. Nous comparons des électrodes avec différents degrés de confinement spatial, en particulier des électrodes fractales et de grille comportant des espaces connectés et déconnectés entre les électrodes, respectivement. Pour les deux électrodes, nous constatons que les processus neuronaux s'accumulent principalement sur l'électrode plutôt que sur les surfaces d'écart et que ce comportement est le plus fort pour les électrodes de grille. Cependant, le caractère "fermé" des espaces entre les électrodes de grille empêche la glie de recouvrir les surfaces des espaces. Ce manque de couverture gliale pour les grilles devrait avoir des effets néfastes à long terme sur la survie neuronale et l'activité électrique. En revanche, les lacunes interconnectées dans les électrodes fractales favorisent la couverture gliale. Nous décrivons les différentes réponses cellulaires aux deux électrodes et émettons l'hypothèse qu'il existe une géométrie optimale qui maximise la réponse positive des neurones et de la glie lors de l'interaction avec les électrodes.

Il y a un intérêt croissant à acquérir une compréhension fondamentale des dispositifs artificiels conçus pour interagir avec les cellules du système nerveux humain. Lorsqu'ils sont implantés dans le corps, ces dispositifs ont des applications potentiellement importantes pour le diagnostic et le traitement de nombreuses maladies neurodégénératives, la rétinite pigmentaire et la dégénérescence maculaire liée à l'âge servant d'exemples courants pour le système visuel1,2,3,4,5,6, 7. Pour les dispositifs comportant des électrodes qui stimulent les neurones, la conception des électrodes doit également tenir compte des interactions avec la glie. Bien que les neurones et la glie aient été découverts à peu près au même moment, la recherche de ces derniers a été plus lente à prendre de l'ampleur8, même s'ils sont répandus dans le système nerveux central9 et jouent un rôle central dans le contrôle de la structure et de la fonctionnalité du réseau neuronal10. En plus d'améliorer les performances des dispositifs médicaux, l'exploration des différences entre les réponses de ces deux types de cellules aux électrodes peut être utilisée pour étudier le comportement fondamental des cellules rétiniennes et la mesure dans laquelle leur comportement peut être contrôlé.

Les stratégies de contrôle de la présence de glie doivent équilibrer leurs impacts positifs et négatifs. Des réponses inflammatoires ainsi que d'autres réponses de la glie peuvent être déclenchées par l'insertion d'implants et leurs micro-mouvements contre le tissu nerveux11,12,13,14,15 ainsi que des inadéquations de leurs propriétés mécaniques (telles que la rigidité) avec le tissu16,17 . Ces effets peuvent créer des « cicatrices » gliales qui séparent l'électrode des neurones ciblés et dégradent son pouvoir stimulant. D'autre part, les techniques visant à éliminer complètement la glie auront des impacts négatifs à long terme sur la survie neuronale, la santé et l'activité électrique18. En effet, la glie sert de système de support de vie aux neurones, fournit des signaux physiques naturels pour leur migration19,20,21 et aide à réguler leur fonction22, à maintenir leur santé23 et à améliorer leur efficacité synaptique24.

Des stratégies pour contrôler les réponses gliales peuvent être mises en œuvre simultanément pour créer l'implant le moins invasif. Il s'agit notamment de réduire la taille de l'implant25, de réduire les inadéquations mécaniques17, d'améliorer la porosité de surface26,27 et de recouvrir l'implant d'un revêtement biomimétique ou bioactif pour le dissimuler potentiellement de la réponse du corps étranger13. Des modifications de la structure physique de la surface, par exemple en introduisant une nano-rugosité ou une impression par micro-contact par lithographie, ont également été utilisées pour contrôler l'attachement et le guidage des cellules28,29,30 à de nombreuses fins, notamment la réduction des réponses gliotiques31.

Une gamme variée de structures nano/micro-motifs ont été étudiées pour leurs interactions avec les cellules gliales et neuronales27,29,31,32,33,34,35,36. La croissance neuronale est améliorée par des surfaces douces et texturées37,38,39,40 grâce à leur ressemblance étroite avec la structure de la matrice extracellulaire (ECM)41,42. En revanche, la couverture gliale due à la croissance et à la division cellulaire est atténuée sur les substrats texturés et plus mous en raison d'interactions de surface affaiblies17,32,43,44,45,46,47. Conformément à ces résultats, une expérience utilisant une co-culture de cellules a démontré que les neurones s'accumulent sur des rangées de nanofils tandis que la glie s'accumule dans les régions plates entre eux31. Malgré tous ces efforts, les mécanismes contrôlant les interactions de différents types de cellules avec différentes surfaces ne sont pas encore pleinement compris.

Notre étude se concentre sur l'importance de la géométrie des électrodes en combinaison avec les propriétés du matériau d'électrode pour contrôler la réponse gliale et le comportement neuronal associé. Nous utilisons des nanotubes de carbone vierges comme matériau conducteur de l'électrode sur la base de nos tests précédents avec des neurones rétiniens et de la glie48. De plus, des études antérieures ont mis en évidence leur capacité à diminuer la formation de tissu cicatriciel glial49 et ont démontré leur capacité à stimuler efficacement les neurones50,51,52 et à booster la transmission du signal53,54,55,56.

En développant des nanotubes de carbone alignés verticalement (VACNT) sur un substrat de dioxyde de silicium (SiO2), nous générons des régions à motifs latéraux d'électrodes texturées (VACNT) et des espaces lisses (SiO2). Sur la base des études ci-dessus des réponses cellulaires à différentes textures, les régions VACNT sont conçues pour accumuler principalement des neurones tandis que les régions SiO2 lisses accumulent de la glie. Grâce à cette conception, les régions VACNT servent d'échafaudage pour les neurones normalement fournis par la glie dans la rétine. En s'accumulant dans les lacunes de cet échafaudage, la glie sera suffisamment proche pour fournir un soutien trophique et métabolique aux neurones sur les électrodes sans bloquer physiquement les interactions neurone-électrode nécessaires à une stimulation maximale. D'une hauteur d'environ 25 µm, les électrodes VACNT agissent comme des barrières à la glie et présentent donc le potentiel de guider la couverture gliale sur la surface de SiO2. Notre étude étudie l'impact du confinement sur le comportement des cellules en considérant un système "fermé", dans lequel les électrodes VACNT forment un réseau d'espaces déconnectés les uns des autres par les parois de restriction, et un système "ouvert" dans lequel les électrodes sont entouré d'espaces connectés.

Plutôt que de mener une étude approfondie de diverses conceptions «fermées» et «ouvertes», nous nous concentrons ici sur deux exemples qui conviennent aux applications d'électrodes et démontrons certains comportements cellulaires fondamentaux qui sont utiles pour éclairer les futures conceptions d'électrodes. Dans ce but, les électrodes de grille et fractales servent d'exemples attrayants de ces deux conceptions. Les deux ont déjà été envisagés pour les électrodes qui s'interfacent avec les neurones et/ou la glie57,58,59,60,61,62,63,64,65. Pour chaque géométrie, les VACNT forment des réseaux continus qui facilitent la polarisation des électrodes (informations supplémentaires). De plus, les grandes capacités électriques générées par leurs géométries devraient améliorer la stimulation des neurones57 et toutes deux permettent la transmission de la lumière à travers leurs lacunes. Cependant, ces propriétés ne sont bénéfiques que si elles s'accompagnent de réponses cellulaires favorables. Notre étude des grilles s'appuie sur une enquête pionnière de 1978 montrant que la glie générée à partir d'une biopsie cérébrale humaine pouvait être confinée dans les chambres d'un motif de grille métallique65. Ce système "fermé" comportait un réseau de chambres déconnectées d'environ 100 µm de largeur. Ici, nous fabriquons des chambres de taille similaire de 60 µm de largeur, qui sont suffisamment grandes pour accueillir plusieurs corps et processus de cellules gliales. Cependant, alors que l'étude originale comportait une culture de glie uniquement, nous employons une co-culture pour permettre l'étude des interactions entre la glie et les neurones. La largeur d'électrode VACNT est choisie pour être WCNT = 20 µm. Cette largeur permet aux somas de plusieurs neurones de se fixer aux surfaces VACNT et à leurs processus de se développer à partir des somas à travers la surface de l'électrode.

En termes de notre choix du système « ouvert », les branches fractales sont répandues dans la nature66,67,68. En plus des plantes, des arbres69 et des rivières70, les réseaux bronchiques71, cardiovasculaires69 et neuronaux72 comportent tous des branches fractales. Leurs branches s'étalent dans l'espace, produisant deux motifs fractals intégrés - les branches et les espaces qui se forment entre elles - et leur relation structurelle peut conduire à une fonctionnalité améliorée. En particulier, les interstices multi-échelles forment un système interconnecté qui s'interface efficacement avec les branches pénétrantes. Alors que, par exemple, cette interaction écart-branche facilite l'exposition à la lumière pour les arbres73 et le transfert d'oxygène pour les arbres bronchiques74, une étude récente menée par les auteurs a étudié les interactions gliales-neurones avec des électrodes fractales fabriquées à partir de VACNTs59. Nos électrodes présentent une géométrie « H-Tree » qui se répète à plusieurs échelles (Fig. 1). Pour faciliter une comparaison avec les grilles, la largeur d'électrode VACNT est choisie pour être de 20 µm et la plus petite largeur d'écart (voir Informations supplémentaires) de 60 µm correspond à la largeur de chambre des électrodes de grille. Cette taille permet à la glie de se connecter aux espaces de plus en plus grands à l'intérieur de l'électrode fractale qui peut être considérée comme un ensemble de chambres interconnectées.

Le masque de lithographie conçoit et des images de microscopie électronique à balayage (SEM) de la grille et des électrodes fractales. (a, b) Masques binaires de la grille et des électrodes fractales respectivement. (c, d) le zoom avant des cases rouges en (a) et (b) montrant certains des paramètres géométriques des deux électrodes (voir la section "Matériaux et méthodes" et les informations supplémentaires pour les définitions). ( e, f ) Images SEM de VACNT dans une région équivalente aux boîtes rouges en ( a ) et ( b ) pour la grille et les électrodes fractales, respectivement. Les tailles de masque en (a) et (b) sont à l'échelle (voir le tableau 1 pour les tailles relatives). Les barres d'échelle en (e) et (f) sont respectivement de 50 et 200 µm.

Nous envisageons des expériences in vitro utilisant une co-culture de neurones rétiniens et de cellules gliales dissociées de souris, car elles fournissent un environnement contrôlé dans lequel la microscopie à fluorescence peut être utilisée pour examiner le comportement cellulaire et les interactions cellule-électrode à mesure qu'elles évoluent sur 17 jours in vitro (DIV) . À l'aide d'observations qualitatives et quantitatives, nous constatons que les électrodes de la grille emprisonnent la glie à l'intérieur des chambres déconnectées, les empêchant de recouvrir les régions lisses de SiO2. En revanche, les électrodes fractales offrent à la glie la possibilité de se diviser et de croître et ainsi de couvrir progressivement des régions SiO2 connectées de plus en plus grandes. Alors que les deux électrodes soutiennent l'adhésion, la croissance et la survie des neurones, nous constatons que les électrodes de grille favorisent la plus grande densité de processus neuronal sur les surfaces VACNT et SiO2 par rapport aux électrodes fractales. Leur géométrie "fermée" augmente la proximité des neurones aux bords d'interface entre les deux surfaces. Ces bords servent de points d'ancrage pour les somas neuronaux et encouragent leurs processus à se développer et à se connecter à d'autres neurones. Nous discuterons des conséquences de cette interaction des deux types de cellules pour la santé et la stimulation cellulaire.

Nous avons fabriqué des géométries H-Tree basées sur le nombre de niveaux répétitifs étant m = 5 et une dimension fractale de D = 2 qui définit le taux de retrait entre ces niveaux (voir Informations supplémentaires pour une explication plus détaillée de m, D et le paramètres géométriques connexes abordés dans cette section)59. Lorsqu'ils sont couplés à WCNT = 20 µm et WSi-min = 60 µm, ces paramètres génèrent une distance maximale de séparation des électrodes de WSi-max = 3,22 × 103 µm et une largeur globale d'électrode de W = 6,26 × 103 µm (tableau 1, Fig. .S1). Le WCNT pour les grilles a été fixé égal aux fractales et leur largeur globale d'électrode a été fixée à W = 3,51 × 103 µm (correspondant à 43 chambres par rangée) pour fournir approximativement la même longueur de bord totale, E, et approximativement la même zone de couverture , ACNT, comme électrode fractale. E a été normalisé car il représente la frontière d'interaction entre les électrodes riches en neurones et les lacunes riches en glie. L'ACNT a également été normalisé pour garantir des quantités similaires de matériau VACNT ainsi que des zones de section transversale similaires pour les deux électrodes lors des interactions initiales avec les cellules. Nous notons qu'en raison des deux électrodes appartenant à des géométries fondamentalement différentes (fractales à plusieurs échelles par rapport aux grilles « euclidiennes » à une échelle), il n'est pas possible de contrôler tous leurs paramètres - par conséquent, les deux électrodes diffèrent dans leur délimitation zones, Abondant, et surfaces SiO2, ASi. Nous notons également que tous les paramètres géométriques fractals ont été calculés en fonction de D, m, W et WCNT, et sont donc interdépendants. Le tableau 1 résume les différents paramètres des deux conceptions d'électrodes.

Des techniques de microfabrication et de lithographie ont été utilisées pour synthétiser les électrodes fractales et de grille VACNT en suivant des procédures qui ont été décrites en détail ailleurs48. En bref, des tranches de silicium de 2 pouces avec une couche supérieure d'oxyde thermique (SiO2) de 300 nm ont été nettoyées et modelées à l'aide de techniques de photolithographie. La plaquette entière contenait 10 grilles individuelles et 8 électrodes fractales individuelles. Après le développement de la résine photosensible, une couche adhésive d'aluminium (Al) de 2 à 5 nm a été déposée thermiquement, suivie d'un dépôt par faisceau d'électrons d'une couche de catalyseur de fer (Fe) de 3 à 5 nm. Après 30 s de trempage dans l'acétone accompagné d'une sonication pour décoller la couche de résine photosensible, la plaquette a ensuite été découpée en échantillons individuels, chaque échantillon comportant une électrode. Tous les échantillons fabriqués n'ont pas été utilisés dans les expériences de culture de cellules dissociées. Certains échantillons ont été éliminés en raison de défauts visibles ou ont été conservés pour une caractérisation SEM plus poussée. Des techniques de dépôt chimique en phase vapeur (CVD) ont été utilisées pour synthétiser des VACNT sur les motifs de catalyseur dans un tube de quartz de 2 pouces. Un mélange 2: 1 d'éthylène (C2H4): hydrogène (H2) (200 et 100 SCCM respectivement) accompagné d'un flux de 600 SCCM d'argon (Ar) a été maintenu pendant le temps de croissance de 3 minutes à 650 ° C. Cette technique a abouti à des électrodes à motifs constituées de «forêts» enchevêtrées de VACNT (Fig. 1, Fig. S2 supplémentaire). Les électrodes ont ensuite été stockées dans des plateaux de circuits intégrés dans une armoire dessiccatrice. La surface supérieure et les parois latérales des VACNT, leurs hauteurs et leurs conditions générales ont été inspectées à l'aide d'un microscope électronique à balayage ZEISS-Ultra-55. Aucune différence visuelle n'a été observée entre les échantillons des deux conceptions d'électrodes et des cycles de fabrication. Les hauteurs de VACNT étaient comprises entre 16 et 36 µm. Pendant la culture, les échantillons ont été placés dans des plaques de culture à 4 puits (Sarstedt, Newton, NC) avec un échantillon par puits.

Des souris C57BL/6J de type sauvage ont été gardées dans les services de protection des animaux de l'Université de l'Oregon (UO) avec un accès à plein temps à l'eau douce et à l'approvisionnement alimentaire. Les procédures de manipulation et de culture impliquant les souris ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'UO dans le cadre du protocole 16-04, conformément aux directives ARRIVE et aux directives des National Institutes of Health pour le soin et l'utilisation d'animaux expérimentaux. animaux. Des cultures de cellules rétiniennes dissociées ont été employées en utilisant des protocoles décrits ailleurs31,48,75. En bref, des souris postnatales au jour 4 (PN4) ont été euthanasiées par décapitation et leurs rétines ont été rapidement disséquées et conservées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM—ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) contenant du glucose, du pyruvate de sodium, de la l-glutamine et du rouge de phénol. . Pour chaque expérience de culture, quatre rétines ont été transférées dans une solution enzymatique contenant du DMEM, de la papaïne (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ) et de la l-cystéine (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Les rétines digérées ont été soigneusement rincées avec du DMEM et transférées dans un nouveau DMEM contenant du B27 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) et de la l-glutamine-pénicilline-streptomycine (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). La solution de rétine dissociée a été centrifugée et le culot cellulaire a été remis en suspension dans la solution DMEM/B27/antibiotique. La suspension cellulaire (500 µL) a ensuite été ensemencée sur chaque puits contenant soit une grille, soit une électrode fractale. Les cellules ont été cultivées pendant 17 DIV à 37°C et 5% de CO2. Le milieu de culture a d'abord été changé à 3 JIV puis tous les deux jours jusqu'à la fin du temps de culture. Aucun protocole tel que le pré-revêtement des surfaces avec de la poly-d-lysine (PDL) ou de la poly-l-lysine (PLL) n'a été utilisé pour augmenter l'adhérence neuronale et gliale aux différents types de surface. La densité de cellules vivantes mesurée par un hémocytomètre était de (3,7 ± 0,4) × 106 cellules/mL.

Le protocole d'immunocytochimie est décrit en détail ailleurs31,48,75. En bref, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 %, rincées avec une solution tamponnée au phosphate (PBS) et pré-incubées dans du PBS-complet, contenant du PBS, Triton-X (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), bovin l'albumine sérique (BSA) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), le sérum normal de chèvre et le sérum normal d'âne (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Les cellules ont ensuite été incubées avec du PBS-complet contenant les anticorps primaires, l'anti-β-tubuline III de souris (marqueur neuronal de plusieurs types de neurones dans la rétine de souris76,77—Sigma-Aldrich, St Louis, MO) et l'anti-fibrillaire gliale de lapin protéine acide (GFAP; marqueur gliale—Agilent, Santa Clara, CA) pendant la nuit à 4 ° C. Les cellules ont ensuite été rincées et incubées avec du PBS complet contenant les anticorps secondaires IgG anti-souris de chèvre Cy3 et IgG anti-lapin d'âne AlexaFluor 488 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). La solution d'anticorps secondaire a ensuite été retirée et les cellules rincées avec du PBS. Les échantillons ont été transférés sur des lames de microscope et montés avec du Vectashield contenant du DAPI (marqueur nucléaire cellulaire fluorescent qui se lie à l'ADN - Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Un microscope à fluorescence inversé Leica DMi8 a été utilisé pour prendre des images 20× dans le Cy3 (excité à 550 nm, pic d'émission à 570 nm), AlexaFluor 488 (excité à 493 nm, pic d'émission à 519 nm) et DAPI (excité à 358 nm , pic d'émission à 461 nm) canaux pour toutes les électrodes. Les surfaces supérieure VACNT et inférieure SiO2 ont été imagées séparément, la mise au point étant ajustée à ces surfaces. Le champ de vision (FOV) de 2048 × 2048 pixel2 (662,65 × 662,65 µm2) dans chaque canal a ensuite été assemblé à l'aide d'un algorithme d'assemblage automatisé avec un chevauchement de 10 % sur les bords des FOV voisins pour créer des images d'électrodes complètes.

Nous avons choisi la croissance des processus neuronaux comme mesure phénotypique morphologique de la santé et de la fonction des cellules neuronales78,79. Cela était en partie basé sur l'objectif à long terme d'utiliser des électrodes pour la stimulation des neurones et la haute densité de sites de stimulation sur les processus. L'analyse quantitative impliquait un calcul de la densité des processus (c'est-à-dire la longueur totale des dendrites et des axones des neurones dans une surface donnée). Sur la base de leur rôle de promotion de l'homéostasie et de la survie des neurones, l'analyse gliale s'est concentrée sur la quantification de la surface exprimant le marqueur cytosquelettique GFAP32. Cette analyse a impliqué un calcul de leur densité de couverture de surface (appelée ci-après « couverture », c'est-à-dire la surface couverte par la glie normalisée à la surface totale disponible).

Pour effectuer cette analyse quantitative59, des masques binaires ont été créés à l'aide d'un algorithme MATLAB pour les électrodes fractales et de grille basé sur le WCNT mesuré à l'aide du canal DAPI des images de fluorescence. Ces masques ont ensuite été appliqués à tous les FOV acceptables pour chaque électrode afin que les surfaces SiO2 et VACNT puissent être analysées séparément. Les FOV inacceptables (par exemple ceux présentant des anomalies telles que des déformations VACNT) étaient rares : généralement 2 FOV sur 50. Un algorithme automatisé d'analyse d'image MATLAB a été intégré à l'algorithme de masque binaire pour détecter et mesurer la longueur du processus par FOV sur les surfaces SiO2 et VACNT séparément. Dans les cas où les processus se chevauchaient physiquement (par exemple, lorsqu'ils étaient «regroupés» et suivaient un itinéraire commun à la surface ou lorsque plusieurs processus suivaient le même bord d'électrode), l'algorithme les détectait comme un seul processus. Cela a entraîné un sous-dénombrement des processus, en particulier sur les surfaces VACNT, mais n'a pas affecté les résultats généraux des expériences. Pour chaque électrode, la longueur de processus normalisée sur les surfaces SiO2 (NSi) et VACNT (NCNT) a ensuite été définie comme la longueur totale du processus sur chaque surface à travers tous les FOV (NLSi ou NLCNT) divisée par la surface totale de cette surface dans le électrode (ASi ou ACNT) :

Pour la glie, un algorithme MATLAB de seuillage semi-automatisé intégré à l'algorithme de masque binaire a été utilisé pour détecter et mesurer la zone gliale par FOV sur les surfaces SiO2 et VACNT séparément. Pour chaque électrode, la surface gliale normalisée sur les surfaces SiO2 et VACNT a ensuite été définie comme la surface gliale totale sur chaque surface sur tous les FOV (GASi ou GACNT) divisée par la surface totale de cette surface :

Pour minimiser l'erreur de détection de la longueur du processus neuronal et de la zone gliale autour des bords des électrodes sur les deux surfaces, les FOV ont été inspectés et les mesures du masque ont été ajustées manuellement si nécessaire pour permettre la détection correcte des caractéristiques au point (voir Fig. S3 supplémentaire). pour des exemples de couverture gliale et d'algorithmes de détection de processus neuronal sur la surface VACNT d'électrodes fractales).

Le test de Shapiro-Wilk a été réalisé pour déterminer la normalité des paramètres neuronaux et gliaux. Étant donné que certaines des distributions ne répondaient pas aux critères de normalité, la comparaison non paramétrique de Kruskal – Wallis pour la signification (avec un niveau de signification de 0, 05) a été utilisée dans MATLAB pour comparer les médianes des paramètres neuronaux et gliaux à diverses hypothèses nulles (par exemple GSi et GCNT étaient testé par rapport à l'hypothèse nulle selon laquelle le matériau de surface n'aurait pas d'impact sur le comportement glial). Les valeurs aberrantes ont été déterminées comme tout point de données inférieur au minimum défini comme Q1-1.5IQR ou au-dessus du maximum défini comme Q3 + 3IQR, où Q1, Q3 et IQR représentent le 25e % quartile, le 75e % quartile et l'intervalle interquartile ( Q3–Q1) respectivement. Un nombre total de 7 électrodes de grille provenant de 3 cultures indépendantes et de 11 électrodes fractales provenant de 5 cultures indépendantes ont été utilisées dans les expériences. Certains échantillons ont été exclus en raison de complications dans les procédures de fabrication ou de culture. Chaque culture indépendante comprenait les deux conceptions d'électrodes.

Tout d'abord, nous nous concentrons sur quelques observations qualitatives du comportement cellulaire. La figure 2 et la figure supplémentaire S4 montrent des images de fluorescence représentatives des interactions cellulaires avec les électrodes. Des cellules gliales ont été observées sur les surfaces SiO2 et VACNT des deux électrodes à 17 DIV. La glie résidant sur le SiO2 n'a jamais étendu les processus sur les surfaces VACNT. En termes de morphologie, la glie présentait une forme étalée avec de multiples processus longs bien définis sur les surfaces de SiO2 des deux électrodes. En revanche, ils avaient une morphologie plus allongée sur les surfaces VACNT des deux électrodes. Ceux-ci ont suivi la forme des surfaces VACNT et, bien que rares, ont même fait des virages à 90 ° aux points de virage VACNT.

Exemples représentatifs d'images de fluorescence de cellules rétiniennes interagissant avec la grille et les électrodes fractales à 17 DIV (vert = glie marquée GFAP ; rouge = neurones marqués β-tubuline III ; bleu = noyaux marqués DAPI). Glia sur les surfaces VACNT de la grille (a) et (b) des électrodes fractales. Glia s'accumulant sur les surfaces de SiO2 de la grille (c) et des électrodes fractales (d). La structure de la glie sur les surfaces VACNT de la grille (e) et des électrodes fractales (f) ainsi que les surfaces SiO2 de la grille (g) et des électrodes fractales (h). Processus neuronaux suivant les électrodes VACNT de la grille (i) et (j) des électrodes fractales. (k) Amas de neurones à l'intérieur des chambres de grille envoyant des processus vers les parois latérales du VACNT. (l) Grands amas de neurones sur la surface SiO2 se connectant aux neurones sur la surface VACNT d'une électrode fractale. Processus neuronaux suivant les électrodes VACNT de la grille (m) et des électrodes fractales (n). (o) Amas de neurones attaché à la paroi latérale VACNT d'une chambre à grille envoyant des processus sur les surfaces SiO2 et VACNT. (p) Amas de neurones et processus de connexion sur les surfaces SiO2 et VACNT d'une électrode fractale. Les images en (c) et (k) montrent le même FOV, comme le font (d) et (l). Les bords des électrodes sont mis en évidence avec des lignes blanches à l'exception des panneaux (i), (j), (m) et (n) qui se concentrent sur le comportement des processus le long des bords car les lignes auraient obscurci ces processus. Les barres d'échelle sont : 10 µm en (e) et (f) ; 20 µm dans (g), (h), (m), (n) et (o); 40 µm en (p); 50 µm dans (a), (b), (c), (i), (j) et (k); et 100 µm en (d) et (l).

Les neurones ont adhéré et développé des processus sur les surfaces SiO2 et VACNT des électrodes fractales et de grille. Pour les deux surfaces, les somas neuronaux se regroupaient parfois et certains des processus reliant les grappes formaient des faisceaux. Ce comportement a été observé plus fréquemment sur la surface SiO2 que sur la surface VACNT (Fig. 2i – l). Les neurones des deux surfaces étaient connectés via des amas attachés aux parois latérales du VACNT et des processus étaient fréquemment observés le long des bords supérieur et inférieur des parois latérales (Fig. 2, Fig. S4 supplémentaire). Les gros amas sur les surfaces de SiO2 étaient beaucoup plus courants pour la fractale que pour les électrodes de grille, en particulier dans les régions accompagnées d'une large couverture gliale. De grands amas étaient parfois évidents dans certaines chambres de grille et cela se produisait le plus souvent lorsque des cellules gliales étaient présentes. Par exemple, sur les figures 2c et k, l'amas de la chambre centrale (qui n'a pas de glie) semble être plus petit que ceux des quatre chambres environnantes (qui sont occupées par de la glie).

Passons maintenant aux mesures quantitatives. Premièrement, l'effet du système de matériaux SiO2 – VACNT sur les distributions gliale et neuronale sur les deux surfaces a été étudié par une comparaison statistique de GSi contre GCNT et NSi contre NCNT pour la grille et les électrodes fractales séparément. Il n'y avait pas de différence significative entre GSi et GCNT pour les grilles (Fig. 3a), alors que GSi était significativement plus élevé pour les fractales (p = 0, 0002, Fig. 3c). NSi était significativement inférieur à NCNT pour les grilles et les fractales (p = 0, 0017 et 0, 0053 respectivement, Fig. 3b, d).

Comparaison du comportement glial et neuronal sur les surfaces SiO2 et VACNT pour la grille et les électrodes fractales à 17 DIV. Analyse statistique montrant les boîtes à moustaches de GSi (à gauche) par rapport à GCNT (à droite) pour les grilles (a) et (c) fractales, ainsi que NSi (à gauche) par rapport à NCNT (à droite) pour les grilles (b) et (d) fractales. Les axes y de (a) et (c) affichent la plage des valeurs GSi et GCNT et les axes y de (b) et (d) affichent la plage des valeurs NSi et NCNT. Les étoiles dans les panneaux (b–d) indiquent les degrés de signification : *** et ** indiquent p ≤ 0,001 et p ≤ 0,01, respectivement. Le plus rouge dans le panneau (d) est une valeur aberrante. Notez que GSi et GCNT sont sans unité et que NSi et NCNT ont des unités de µm−1 (voir la section "Matériels et méthodes").

Après avoir évalué l'effet des régions SiO2 et VACNT sur les distributions gliale et neuronale pour chaque conception d'électrode séparément, nous avons ensuite comparé le succès des deux électrodes dans l'obtention des distributions cellulaires souhaitées (c'est-à-dire la concentration des neurones et de la glie dans les régions VACNT et SiO2, respectivement). Les figures 4a et b montrent des diagrammes de dispersion de GSi par rapport à GCNT et NCNT par rapport à NSi pour la grille et les électrodes fractales. Les lignes noires représentent les conditions GSi = GCNT et NCNT = NSi. Toutes les fractales ont atteint avec succès la condition GSi > GCNT, alors que seulement 2 grilles sur 7 l'ont fait. En revanche, toutes les grilles ont réussi à atteindre la condition NCNT > NSi, alors que 9 fractales sur 11 ont réussi à le faire. Les lignes rouges et bleues pleines correspondent à zéro pour les grilles et les fractales et sont incluses comme guides pour l'œil. Bien que ces guides linéaires soient utiles pour comparer les données aux conditions GSi = GCNT et NCNT = NSi (représentées par les pentes des lignes noires), nous n'utilisons pas ces ajustements pour impliquer un comportement strictement linéaire (les valeurs R2 sont égales à 0,06 pour la grille et 0,32 pour les ajustements fractal GSi versus GCNT, et 0,71 pour la grille et 0,41 pour les ajustements fractal NCNT versus NSi).

Etude de la relation de GSi avec GCNT et NCNT avec NSi pour la grille et les électrodes fractales. ( a ) Nuage de points de GSi par rapport à GCNT pour les grilles (rouge) et les fractales (bleu). ( b ) Nuage de points de NCNT par rapport à NSi pour les grilles (rouge) et les fractales (bleu). Les lignes noires pleines représentent les conditions GSi = GCNT et NCNT = NSi en (a) et (b), respectivement. Les lignes rouges et bleues pleines correspondent à zéro pour les grilles et les fractales, respectivement.

Enfin, la grille et les électrodes fractales ont été comparées directement pour chacun des quatre paramètres (GSi, GCNT, NSi et NCNT). En termes de comportement glial, les résultats des comparaisons statistiques ont confirmé que les fractales avaient un GSi significativement plus élevé que les grilles (p = 0,0018, Fig. 5a), tandis que les grilles avaient un GCNT significativement plus élevé que les fractales (p = 0,0164, Fig. 5b) . Compte tenu du comportement neuronal, les grilles avaient des NSi et des NCNT significativement plus élevés que les fractales (p = 0, 0333 et 0, 0013, respectivement, Fig. 5c, d). La valeur aberrante fractale dans les Figs. 3d et 5c ont le NSi le plus bas probablement en raison de la plus faible valeur de GSi parmi toutes les fractales (ce faible GSi était dû à des variations entre différentes électrodes au sein d'une culture).

Comparaison entre la grille et les électrodes fractales à 17 DIV en termes de comportement glial et neuronal sur les surfaces SiO2 et VACNT. Analyse statistique montrant des boîtes à moustaches de (a) GSi, (b) GCNT, (c) NSi et (d) NCNT entre la grille et les électrodes fractales. Les étoiles dans tous les panneaux indiquent les degrés de signification : ** et * indiquent p ≤ 0,01 et p ≤ 0,05, respectivement. Le plus rouge dans le panneau (c) est une valeur aberrante.

Nos expériences se sont appuyées sur le comportement bien établi selon lequel les cellules gliales s'accumulent sur des surfaces lisses plutôt que texturées31,44,45,48. Alors que la plupart des études précédentes portaient sur des cultures gliales pures sur des substrats constitués d'un seul matériau présentant différentes textures, nous nous sommes concentrés ici sur les co-cultures neurones-glies rétiniennes sur un système multi-matériaux (SiO2 lisse et VACNT texturé) pour confirmer que différents types de cellules au sein d'une co-culture pourrait être amenée à s'accumuler sur différentes régions par manipulation de la texture de surface31. Pour y parvenir, nous avons combiné la structuration latérale à l'échelle du micron des VACNT (avec une hauteur moyenne de 25 µm) avec leurs effets de nano-rugosité de surface, contrairement aux études précédentes qui utilisaient des surfaces nano-rugueuses sans motif32,45,49, nano- ondulations et micro-rainures46, et nanofils31. Nous avons constaté que, comme prévu, les morphologies cellulaires observées sur les deux surfaces étaient cohérentes avec celles observées dans les études texturales précédentes32,59. Cependant, les grandes hauteurs de VACNT se sont avérées être un facteur important dans la conception de notre système - la glie résidant sur le SiO2 n'a jamais étendu les processus sur les surfaces de VACNT. En tant que telles, les électrodes VACNT ont agi comme des barrières à la glie et ont donc guidé la couverture gliale à travers la surface de SiO2. Compte tenu de l'impact de la taille de l'espace sur le comportement glial, la plus petite taille d'espace dans la conception fractale, WSi-min, n'a pas empêché la couverture gliale de s'étendre entre les espaces fractals, comme le suggère la morphologie étendue de la glie située dans le WSi-min lacunes (Fig. 2d, Fig. Supplémentaire S4). Les plus petites régions de SiO2 au sein de l'électrode fractale étaient donc connectées à des zones de plus en plus grandes, offrant à la glie la liberté d'étendre leur couverture à travers ces grandes régions (Fig. S4 supplémentaire). Bien que la taille des chambres de la grille corresponde au WSi-min des électrodes fractales, le caractère déconnecté des électrodes de la grille a empêché les cellules gliales qui résidaient dans une chambre d'accéder à d'autres régions de l'électrode (Fig. 2c). Cela a laissé des régions dans l'électrode de grille dépourvues de glie et a donné aux grilles des valeurs de GSi nettement inférieures à celles des électrodes fractales (Fig. 5a). Cela peut avoir des effets négatifs importants sur la survie et la fonction des neurones à long terme car il est bien connu que la glie agit comme le système de support de la vie des neurones80,81 et que leur présence améliore considérablement les connexions synaptiques entre les neurones82.

Compte tenu du comportement neuronal sur les surfaces de SiO2, les neurones dépendent de l'adhérence de surface pour leur développement et leur survie. En raison de leur plus grande proximité avec les parois latérales du VACNT, les neurones dans les chambres de la grille avaient plus de chances d'adhérer et de développer leurs processus le long des bords des électrodes que ceux des plus grands espaces fractals. Cette attraction des processus vers les parois latérales plutôt que vers les surfaces SiO2 aurait pu être davantage encouragée par des signaux chimiques (facteurs neurotrophiques)83,84,85,86 provenant des neurones et de la glie sur les surfaces VACNT, réduisant potentiellement le NSi pour les grilles par rapport aux fractales. Cependant, nous émettons l'hypothèse qu'un autre comportement lié à l'adhérence dominait, ce qui faisait que le NSi était le plus bas pour les fractales. Les fortes forces d'adhésion cellule-VACNT subies par les neurones auraient rivalisé avec les forces d'agrégation neurone-neurone, ralentissant la formation de clusters dans les chambres de la grille. En revanche, les neurones dans les lacunes fractales auraient été moins susceptibles de rencontrer les bords VACNT, entraînant une tendance plus élevée à l'agrégation de leurs somas en grappes plus grandes. La présence de cellules gliales a également favorisé ce modèle d'agrégation. Au cours de l'agrégation, les processus reliant les clusters plus grands ont diminué, certains se rejoignant pour former des faisceaux, ce qui a ensuite contribué à la diminution de NSi car l'algorithme de détection de processus comptait généralement chaque faisceau comme un lien entre les clusters (voir la section "Matériels et méthodes"). Ce comportement de regroupement a même laissé de nombreux emplacements dans les lacunes fractales complètement vides de processus. Il est donc possible que la dominance de ce deuxième motif dépendant de l'adhérence puisse expliquer les valeurs NSi significativement plus faibles pour les espaces fractals par rapport aux chambres de grille (Fig. 5c).

Conformément aux résultats précédents 48, 53, les surfaces VACNT ont soutenu une croissance du processus neuronal qui était plus importante que les surfaces SiO2 pour les électrodes fractales et de grille (Fig. 3b, d). La nano-rugosité du CNT imite certaines des propriétés de l'ECM en fournissant une croissance guidée du processus neuronal et une meilleure adhérence des neurones41,42. De plus, ils offrent une flexibilité mécanique favorable qui peut améliorer la croissance et la ramification des processus neuronaux87, établissant ainsi un environnement approprié pour l'adhésion, la survie et la croissance neuronales sans nécessiter de modification chimique supplémentaire de la surface48. Cela a entraîné des valeurs NCNT significativement plus élevées que NSi pour la grille (Fig. 3b) et les électrodes fractales (Fig. 3d). En raison de leur sensibilité aux repères topographiques31,33,88,89, les processus avaient tendance à suivre les bords supérieur et inférieur des parois latérales du VACNT pour les deux électrodes (Fig. 2i, j, Fig. S4 supplémentaire). La grande longueur de bord connectée des deux conceptions d'électrodes a permis aux grappes de se former et de s'ancrer aux parois latérales du VACNT. Les valeurs NCNT plus élevées pour les grilles par rapport aux fractales (Fig. 5d) s'expliquent probablement par les plus grandes chances de grappes ancrées aux parois latérales VACNT de la grille facilitant de plus grandes connexions entre les processus dans les chambres et ceux sur les surfaces VACNT (Fig. 2o et Fig. Supplémentaire S4).

Maintenant, nous considérons pourquoi GCNT est plus élevé pour les grilles que pour les fractales. Ceci est déroutant car les deux électrodes ont des valeurs ACNT similaires et les surfaces VACNT entravent la division et la croissance cellulaire59. Sur la base de ces considérations, nous nous attendrions à ce que le GCNT soit similaire pour les deux électrodes. Bien que spéculatives, les surfaces VACNT riches en neurones de la grille pourraient avoir déplacé le sort de certaines des cellules progénitrices rétiniennes existantes dans l'environnement90,91 vers la glie. On sait que, in vivo, les cellules souches/progénitrices neuronales ont la capacité de se différencier en différents types de cellules neurales92 en fonction des signaux physiques, biochimiques et topographiques présents dans leur environnement93 et ​​peut-être que cet effet s'étend à notre environnement in vitro62,94. En conséquence, les valeurs NCNT plus grandes pour les grilles sur les fractales (Fig. 5d) pourraient avoir induit leurs valeurs GCNT plus grandes (Fig. 5b). Cette relation entre les neurones et la glie sur les surfaces VACNT des grilles est en outre suggérée par la Fig. 6.

Etude de la relation de GCNT avec NCNT pour la grille et les électrodes fractales. Nuage de points de GCNT par rapport à NCNT pour les grilles (rouge) et les fractales (bleu).

En revenant aux figures 5a et b, les valeurs plus petites de GSi et les valeurs plus grandes de GCNT pour les grilles par rapport aux fractales se combinent pour générer l'absence de différence significative entre les deux paramètres de la figure 3a. En revanche, les valeurs plus grandes de GSi et les valeurs plus petites de GCNT sur les figures 5a et b conduisent à la différence significative pour les fractales vues sur la figure 3c. Bien que NCNT soit significativement plus grand que NSi pour les grilles et les fractales, la différence est plus grande pour les grilles (Fig. 3b, d). Ces caractéristiques sont également visibles sur la figure 4. Les données fractales se situent plus haut au-dessus de la ligne noire que les données de grille sur la figure 4a et l'inverse est vrai pour la figure 4b. L'augmentation observée de NCNT avec NSi sur la figure 4b est cohérente avec l'hypothèse ci-dessus de clusters ancrés aux parois latérales de VACNT assurant la médiation de connexions via des processus entre les neurones dans les chambres et ceux sur les surfaces de VACNT.

En ce qui concerne l'objectif sous-jacent d'accumuler de la glie sur les surfaces de SiO2 et des neurones sur les surfaces de VACNT, les électrodes fractales ont mieux performé sur les premières et les électrodes de grille sur les dernières. Cependant, on s'attend à ce que le manque relatif de cellules gliales proches pour les neurones sur les surfaces de la grille VACNT ait des effets néfastes sur leur survie et leur activité électrique à long terme. Bien que le but de l'étude actuelle était de considérer les chambres de grille à l'échelle des corps cellulaires gliaux individuels, il est instructif de considérer l'impact de l'augmentation de la taille de la chambre. Si des grilles plus grandes devaient être fabriquées, certains effets bénéfiques pour la couverture de la surface gliale pourraient être obtenus. Cependant, bien que des chambres plus grandes puissent offrir une liberté physique accrue pour la couverture gliale en raison de leur géométrie moins restreinte, il y aurait une réduction concomitante de la proximité des VACNT. Cela aurait de multiples impacts négatifs : (1) les neurones et la glie bénéficient de signaux chimiques83,84 les uns des autres et les deux types de cellules se développent lorsqu'ils sont à proximité. La mise en œuvre de grilles avec des chambres plus grandes réduira cette proximité entre la glie au milieu des chambres et les neurones sur les surfaces VACNT, (2) la glie au milieu des chambres attirera plus de neurones loin des parois latérales VACNT. Cela augmente la distance entre les neurones au milieu de la chambre et ceux ancrés sur les parois latérales (qui assurent la médiation des connexions entre les deux surfaces), ce qui pourrait réduire le NCNT, (3) pour les chambres de très grande taille, la probabilité d'avoir des zones vides dépourvues de cellules augmente59 ce qui entraîne un gaspillage d'espace dans la conception des électrodes, (4) la densité spatiale réduite des VACNT fournira une surface moins texturée pour soutenir et stimuler les neurones. La Fig. S5 supplémentaire compare la conception fractale à des grilles présentant une gamme de tailles de chambre et calcule deux paramètres géométriques pour explorer l'équilibre théorique entre la connectivité de l'écart et la proximité de l'écart atteint par les deux conceptions d'électrodes. Les expériences futures devraient s'appuyer sur cette modélisation initiale pour confirmer les propriétés favorables de la fractale sur une gamme de tailles de grille.

Après avoir établi une couverture gliale supérieure dans les lacunes des électrodes fractales, nous passons maintenant à discuter de la quantité de glie nécessaire pour maintenir les neurones sains et fonctionnels sur les électrodes VACNT. Afin d'étudier la corrélation entre la glie à l'intérieur des lacunes de SiO2 et les neurones sur les électrodes VACNT, nous avons tracé NCNT par rapport à GSi sur la figure 7. Compte tenu de la conception fractale, NCNT augmente avec GSi avec l'ajustement linéaire décrit par un R2 de 0,63. . Nous n'utilisons pas cet ajustement pour impliquer un comportement strictement linéaire, mais plutôt pour mettre en évidence les observations clés suivantes. Premièrement, la tendance des données suggère qu'une absence de glie (c'est-à-dire GSi = 0) entrave considérablement la croissance des processus neuronaux. Cependant, les données ne révèlent pas de limite inférieure distincte (c'est-à-dire une valeur GSi en dessous de laquelle NCNT tombe à zéro). Ceci est étayé par des observations qualitatives montrant qu'il existe certaines régions VACNT qui prennent en charge les processus même en l'absence de glie à proximité. Deuxièmement, lorsque les variations de GSi au sein de la culture entraînent plus de cellules gliales, cette présence accrue favorise la croissance neuronale. Alors qu'il est possible que de nouvelles augmentations de GSi puissent éventuellement provoquer la saturation de NCNT ou même montrer un épuisement95,96, notre système fractal à 17 DIV fonctionne dans un régime dans lequel il n'y a pas de limite supérieure - plus il y a de glie, mieux c'est. En comparant les variations au sein de l'électrode fractale, la croissance du processus neuronal peut être considérée comme un indicateur de santé car tous les autres facteurs géométriques sont constants. Nous soulignons que cette hypothèse ne peut pas être étendue aux comparaisons entre les deux géométries d'électrodes. En particulier, les valeurs NCNT plus élevées obtenues par les grilles par rapport aux fractales proviennent des facteurs géométriques discutés précédemment (c'est-à-dire les parois latérales facilitant de plus grandes connexions entre les régions SiO2 et VACNT) ainsi que les valeurs GCNT plus grandes de la grille. Pour être complet, nous incluons l'ajustement linéaire pour les grilles, mais notons que les valeurs GSi nettement inférieures de la grille excluent les observations significatives concernant la relation entre NCNT et GSi.

Etude de la relation de NCNT avec GSi pour la grille et les électrodes fractales. Nuage de points de NCNT par rapport à GSi pour les grilles (rouge) et les fractales (bleu). Les lignes rouges et bleues pleines correspondent à zéro pour les grilles et les fractales, respectivement.

La discussion ci-dessus se concentre sur les quantités relatives de glie qui sont favorables à notre système plutôt que de déclarer des valeurs absolues pour des systèmes plus larges. Des études antérieures soulignent que les populations de types de cellules et, par conséquent, les ratios neurones/glie peuvent varier considérablement entre les souches de la même espèce de mammifère97 et entre les sous-régions de la même structure en fonction de la densité neuronale9. Avec la compréhension actuelle du rapport glie-neurone, il est difficile de déterminer une limite inférieure ou supérieure pour le nombre de glie nécessaire dans les lacunes pour garantir la santé et la survie des neurones sur les électrodes VACNT. Des études antérieures ont affirmé qu'une occupation gliale minimale est nécessaire pour protéger les neurones de la mort, mais n'ont pas quantifié le degré d'occupation nécessaire95. Nous reconnaissons également que la couverture gliale et les arrangements cellulaires rapportés dans notre système in vitro sont très différents de la couverture gliale et des distributions cellulaires dans un tissu nerveux gliotique affecté par des conditions neurodégénératives15,81 ou l'insertion d'un implant14,15. Une meilleure compréhension du rapport glie/neurone approprié nécessite de futures expériences qui utiliseraient des modèles in vivo de rétines dégénératives telles que la dégénérescence maculaire.

Enfin, nous comparons nos recherches actuelles sur la grille et les électrodes fractales à des études antérieures de ces deux géométries. À partir des grilles, diverses formations ont figuré dans les enquêtes gliales. L'étude de 1978 discutée précédemment a fourni une première démonstration que les chambres de grille sans cellules gliales le sont restées tout au long de l'expérience65, malgré des différences de hauteur négligeables entre les chambres de grille et leurs zones revêtues environnantes. Les électrodes de grille dans nos études ont des parois beaucoup plus hautes par rapport à l'étude de 1978. Cela souligne le rôle restrictif accru des parois des électrodes par rapport au rôle restrictif des surfaces adhérentes et non adhérentes. En termes de dépendance à la taille, des études ont montré une augmentation de la couverture gliale en fonction de l'augmentation de la surface dans un réseau de grille utilisant des tailles de chambre allant de 75 à 200 µm98. Pour les motifs de grille définis par des tranchées64, le plus grand espacement de tranchées de 500 µm a fourni la couverture gliale la plus élevée. Ces résultats soulignent la préférence gliale pour les géométries avec plus de degrés de liberté spatiale. Par exemple, les tranchées peuvent être considérées comme équivalentes aux lacunes connectées dans notre étude et, par conséquent, à la glie accumulée en elles. Ces résultats étaient donc cohérents avec notre discussion sur la liberté physique favorisant la couverture gliale. D'autres études ont étudié l'interaction des neurones avec des modèles de grille de hauteurs négligeables34,63. Celles-ci ont montré que les neurones suivaient les schémas et ne s'en écartaient que dans des cultures plus longues. Dans le cas de nos études, la hauteur des électrodes peut potentiellement fournir un confinement plus robuste des neurones et de leurs processus à la surface des électrodes pendant des durées plus longues. Dans une autre étude, il a été démontré que les neurones de l'hippocampe et la glie colocalisaient sur des modèles de grille avec des hauteurs négligeables dans 26 cultures DIV62. L'objectif de cette étude était fondamentalement différent du nôtre où nous visons à guider les deux types de cellules dans différentes régions de l'électrode tout en les gardant à proximité l'une de l'autre. Alors que la plupart des études précédentes discutées ici se sont concentrées sur des cultures gliales ou neuronales pures, nous avons étudié une co-culture de neurones et de cellules gliales pour observer leur comportement dans des conditions plus similaires aux tissus in vivo. Bien que façonnées par une conception en grille, ces études ont utilisé des approches chimiques pour guider les cellules vers les zones souhaitées. Ces approches peuvent ne pas être suffisamment stables pour les applications in vivo et sont fondamentalement différentes de notre étude actuelle dans laquelle les lacunes offrent la possibilité aux cellules d'étendre leur couverture par la croissance et la division cellulaire.

De même, le choix du design fractal comme représentant d'une géométrie « ouverte » est basé sur une attention expérimentale préalable59. Alors que l'étude actuelle s'est concentrée sur l'aspect «ouvert» par rapport à «fermé» de la connexité des écarts, dans une étude complémentaire récente, nous avons examiné le caractère multi-échelle des écarts fractals et fait varier les deux paramètres fractaux centraux, D et m. L'augmentation de D a réduit la vitesse à laquelle les espaces se sont élargis, conduisant à des espaces relativement petits avec des couvertures gliales élevées en raison de leur proximité avec les électrodes riches en neurones59. Bien que physiquement "ouvertes", toutes les largeurs d'écart dans les fractales pour la conception m = 6 étaient suffisamment étroites pour limiter l'expansion des cellules. En revanche, la couverture gliale a augmenté pour m = 4 et 5 aux niveaux révélés dans l'étude actuelle en raison des valeurs WSi-min plus élevées créant un système «ouvert». L'emploi des paramètres D = 2, m = 5 dans la présente étude a donc été choisi pour assurer un système « ouvert » pour la comparaison avec la grille « fermée ».

Dans cette étude, nous avons utilisé la microscopie à fluorescence pour étudier le comportement fondamental des neurones rétiniens et de la glie de souris lorsqu'ils interagissaient avec des électrodes dans un environnement in vitro pour 17 DIV. L'étude a démontré l'importance de la géométrie des électrodes en combinaison avec les propriétés du matériau d'électrode pour contrôler la réponse gliale et le comportement neuronal associé. En cultivant des VACNT sur un substrat de SiO2, nous avons généré des régions à motifs latéraux de surfaces texturées (VACNT) et lisses (SiO2). Sur la base d'études antérieures sur les réponses cellulaires à différentes textures de surface, les régions SiO2 lisses ont été introduites dans la conception des électrodes pour accumuler principalement de la glie tandis que le rôle des régions VACNT texturées était d'accumuler des neurones. Suite à cette stratégie, nous avons démontré qu'un système « ouvert » composé de lacunes SiO2 connectées avec plusieurs échelles dans une conception fractale encourage la couverture gliale par rapport à un système « fermé » comportant un tableau de lacunes déconnectées dans une grille. En revanche, l'électrode de grille a mieux réussi à accumuler des neurones sur les surfaces VACNT, potentiellement en raison de la proximité des neurones avec les parois latérales VACNT. Cependant, on s'attend à ce que le manque relatif de cellules gliales à proximité des neurones sur la grille VACNT ait des effets néfastes sur leur survie et leur activité électrique95.

L'étude actuelle n'était pas destinée à être une enquête approfondie sur les différentes géométries possibles, mais avait plutôt pour objectif de démontrer certains comportements fondamentaux pour éclairer les conceptions futures en comparant deux exemples. Notre choix d'électrodes de grille et fractales comme représentants des systèmes «fermés» et «ouverts» s'appuie sur des études antérieures de ces géométries en termes d'applications et de comportement fondamental des cellules. Sur la base de nos comparaisons expérimentales, les futures conceptions d'électrodes devraient inclure un équilibre entre la connectivité et la proximité des écarts. Nous avons présenté deux paramètres possibles pour quantifier ces effets dans les informations supplémentaires et avons expliqué comment la connectivité des fractales combinée à une proximité relativement grande donne aux cellules de meilleures chances de survie par rapport aux grilles.

Sur la base de ces résultats, nous émettons l'hypothèse qu'il existe une combinaison optimisée de matériau et de géométrie qui maximisera les réponses positives des différents types de cellules dans le tissu interagissant avec une électrode. A titre d'exemple, le motif fractal actuel peut être modifié par élimination ou rotation de branche pour éliminer les barrières dans la région de l'espace central de l'électrode tout en connectant le motif à un rectangle limite pour maintenir une électrode continue. De telles stratégies augmentent la connectivité et l'accessibilité des lacunes de SiO2 pour la glie tout en maintenant leur proximité avec les branches VACNT à peu près la même (Fig. S6a, b supplémentaire). Contrairement à ces modifications positives, l'introduction de branches supplémentaires dans la conception fractale pour augmenter la proximité peut avoir des conséquences négatives, en particulier la création de régions SiO2 fermées qui réduisent la connectivité de la géométrie (Fig. S6c supplémentaire). A long terme, cette optimisation pourrait être utilisée pour maximiser l'efficacité des dispositifs implantables d'enregistrement et de stimulation neuronale.

Bien que notre étude démontre la capacité fondamentale à contrôler les distributions spatiales de la glie et des neurones, les futures expériences devront confirmer les bénéfices en termes de santé des neurones et de leur stimulation électrique. Compte tenu des conséquences sur la santé, les électrodes fractales actuelles fonctionnaient dans un régime dans lequel la présence accrue de glie à proximité était corrélée à une croissance accrue des processus neuronaux sur les électrodes, indiquant une approche «plus il y a de glie, mieux c'est» pour la santé des neurones. Nous avertissons que ce régime opérationnel ne devrait pas être universel et que les limites supérieures de l'accumulation gliale pourraient devoir être identifiées et quantifiées pour certains systèmes. En particulier, bien que nos études in vitro représentent un modèle contrôlé de comportement in vivo, les différences entre ces environnements devront être prises en compte à long terme. Par exemple, des expériences in vivo impliqueront des interactions d'électrodes avec un tissu neural tridimensionnel structurellement intact. La glie sera alors présente dans la couche d'électrode (c'est-à-dire s'accumulant dans les espaces entre les électrodes de 25 µm de haut) et dans les couches rétiniennes au-dessus de l'électrode. Concrètement, on constate que l'électrode implantée va s'interfacer avec un tissu rétinien malsain qui présente déjà des signes de gliose réactive et qui est remodelé par rapport à un tissu sain99,100. Par conséquent, la glie excessive dans l'espace tridimensionnel au-dessus de l'électrode devra être guidée loin des surfaces VACNT servant d'interface neurone-électrode. Guider la glie dans les espaces connectés de l'électrode attirera plus de neurones à la surface de l'électrode99. Les contributions relatives à la santé de la glie dans les espaces entre les électrodes et celles de la couche rétinienne au-dessus de l'électrode constituent une question intéressante. Cependant, les futures électrodes devraient assumer un caractère plus tridimensionnel en utilisant des VACNT à rapport d'aspect plus élevé, permettant à l'électrode de pénétrer plus profondément dans le tissu neural et d'être plus proche des neurones ciblés. La couche d'interface jouera alors un rôle croissant pour ces futures conceptions d'électrodes.

En ce qui concerne la stimulation électrique, des études antérieures ont démontré le potentiel élevé des NTC en tant que système matériel. Les NTC sans motif et à motifs ont été polarisés électriquement pour stimuler50,101, enregistrer51,102 et même stimuler la signalisation électrique dans les neurones51,103. Cependant, ces études antérieures n'ont pas étudié l'impact de l'arrangement cellulaire. Les études futures devront étudier dans quelle mesure les propriétés de stimulation favorables mises en évidence dans les études précédentes peuvent être améliorées grâce à l'arrangement des réseaux de cellules présentés dans notre étude. Ici, nous avons utilisé des électrodes à grande échelle pour explorer l'arrangement holistique des cellules. Leur traduction en implants stimulant le cerveau ou la rétine devrait s'adapter à des résolutions plus élevées et nous considérons ici plusieurs approches potentielles (Fig. S7 supplémentaire). La traduction la plus simple serait d'employer l'électrode fractale comme électrode active délimitée par une électrode de masse rectangulaire présentant un espace pour permettre le passage de l'électrode active. Cependant, l'électrode active devrait être réduite ou subdivisée en électrodes de composants pour correspondre aux tailles des implants cérébraux typiques. Une approche plus attrayante, applicable aux implants rétiniens, utiliserait la fractale à grande échelle comme électrode de masse avec un réseau de petits trous définis le long de ses branches. Chaque trou encapsulerait alors une électrode carrée active déposée sur une couche de photodiode séparée de l'électrode de masse par un isolant (voir références 56, 57 pour des simulations de ce fonctionnement de photodiode). Les recherches futures se concentreront sur le remplacement des électrodes actives carrées par des électrodes fractales pour potentiellement encourager la croissance des processus et également pour augmenter leur capacité électrique et donc leur capacité à stimuler les neurones57,58. Dans cette approche, les lacunes de SiO2 pour accueillir la glie se feraient au détriment de ne pas avoir un réseau très dense d'électrodes actives. Cependant, ils assureront une interface neurone-électrode plus saine. Si les principes généraux présentés dans l'étude actuelle s'étendent aux implants in vivo, ils garantiront qu'un grand nombre de neurones résident dans les champs stimulants des électrodes et que leur santé prolongée fournie par la glie voisine se traduira par une stabilité de fonctionnement.

Toutes les données et le code associé sont disponibles sur : https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20044022.

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Nous remercions M. Pluth (Université de l'Oregon) pour avoir fourni l'opportunité et la formation pour le système d'imagerie par microscopie à fluorescence. L'instrumentation de microscopie a été prise en charge par la NSF (CHE-1531189). Nous remercions également D. Miller et K. Zappitelli (Université de l'Oregon) pour leurs contributions à la construction du système CVD et au développement du processus de synthèse VACNT.

RPT, CMN et BJA : Fondation WM Keck ; Université de l'Orégon. RPT, WJW et MTP : Institut Pufendorf. RPT : La Fondation Héritage Vivant ; La Fondation Ciminelli ; Le Conseil de la recherche pour l'avancement des sciences. MTP : Conseil suédois de la recherche—# 2016-03757 ; NanoLund à l'Université de Lund ; Stiftelsen för Synskadade i fd Malmöhus Län ; Comité pour les aveugles de la princesse héritière Margareta; La Fondation Craford. BJA : Fondation nationale des sciences -# DMR-1532225 ; Fiducie caritative MJ Murdock.

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Christophe M. Niell

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Division d'ophtalmologie, Département des sciences cliniques de Lund, Université de Lund, 221 84, Lund, Suède

Marie-Thérèse Pérez

NanoLund, Université de Lund, 221 00, Lund, Suède

Marie-Thérèse Pérez

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Tous les auteurs ont participé à la conception de l'étude ; SM, CR, JHS et WJW ont créé les algorithmes d'analyse neuronale et gliale ; SM, WJW et BJA ont développé le processus de synthèse VACNT ; BJA a conçu et mis en œuvre la plate-forme VACNT ; SM et CR ont fabriqué des électrodes VACNT, MTP a développé les protocoles de culture cellulaire et d'immunocytochimie ; SM, CR et JHS ont effectué des cultures de cellules rétiniennes et une microscopie à fluorescence ; SM, CR, JHS et WG ont effectué le traitement des images, SM a effectué l'analyse des données statistiques ; SM, CR et RPT ont effectué l'analyse et la validation des données ; SM, CR et RPT ont conçu les figurines ; SM, CR et RPT ont aidé à éditer les chiffres ; SM et RPT ont rédigé le manuscrit ; RPT a coordonné le projet ; tous les auteurs ont édité le manuscrit.

Correspondance à Richard P. Taylor.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

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Reçu : 10 juin 2022

Accepté : 30 septembre 2022

Publié: 20 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-21742-y

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