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Nov 30, 2023

Les moustiques du paludisme acquièrent et répartissent l'urine de bétail pour améliorer les traits d'histoire de vie

Journal du paludisme

Malaria Journal volume 21, Article number: 180 (2022) Citer cet article

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L'acquisition et l'allocation des nutriments intègrent les traits de recherche de nourriture et d'histoire de vie chez les insectes. Pour compenser le manque d'un nutriment particulier à différents stades de leur vie, les insectes peuvent les acquérir par une alimentation supplémentaire, par exemple, sur les sécrétions de vertébrés, dans un processus connu sous le nom de flaques. Le moustique Anopheles arabiensis émerge sous-alimenté et, à ce titre, a besoin de nutriments pour son métabolisme et sa reproduction. Le but de cette étude était d'évaluer si An. arabiensis s'adonnent à la formation de flaques d'urine de bétail pour obtenir des nutriments permettant d'améliorer les traits d'histoire de vie.

Pour déterminer si An. arabiensis sont attirés par l'odeur de l'urine fraîche de bovins âgés de 24 h, 72 h et 168 h, les femelles en recherche d'hôte et nourries de sang (48 h après le repas de sang) ont été dosées dans un olfactomètre à tube en Y, et les femelles gravides ont été évaluées dans un test de ponte. Des analyses chimiques et électrophysiologiques combinées ont ensuite été utilisées pour identifier les composés bioactifs dans les quatre classes d'âge de l'urine de bovins. Des mélanges synthétiques de composés bioactifs ont été évalués dans des essais en tube en Y et sur le terrain. Pour étudier l'urine de bovin et son principal composé azoté, l'urée, en tant que complément alimentaire potentiel pour les vecteurs du paludisme, les paramètres d'alimentation et les traits d'histoire de vie ont été mesurés. La proportion de moustiques femelles et la quantité d'urine et d'urée de bétail imbibées ont été évaluées. Après l'alimentation, les femelles ont été évaluées pour la survie, le vol captif et la reproduction.

Chercheur d'hôte et nourri de sang An. arabiensis ont été attirés par l'odeur naturelle et synthétique de l'urine fraîche et vieillie des bovins dans les études en laboratoire et sur le terrain. Les femelles gravides étaient indifférentes dans leur réponse à la présence d'urine de bovins sur les sites de ponte. Les femelles à la recherche d'un hôte et nourries au sang s'imposaient activement de l'urine et de l'urée de bovins et allouaient ces ressources en fonction des compromis du cycle biologique entre la fuite, la survie ou la reproduction, en fonction de l'état physiologique.

Anopheles arabiensis acquiert et répartit l'urine des bovins pour améliorer les traits d'histoire de vie. L'alimentation supplémentaire à base d'urine de bovins affecte directement la capacité vectorielle en augmentant la survie quotidienne et la densité des vecteurs, ainsi qu'indirectement en modifiant l'activité de vol, et devrait donc être prise en compte dans les futurs modèles.

L'acquisition et l'allocation des nutriments intègrent les traits de recherche de nourriture et d'histoire de vie chez les insectes [1,2,3]. Les insectes sont capables de sélectionner et d'acquérir des régimes alimentaires, et de se nourrir de manière compensatoire, en réponse à la disponibilité de la nourriture et aux besoins en nutriments [1, 3]. L'allocation des nutriments dépend des processus du cycle biologique et peut entraîner des besoins différents en termes de qualité et de quantité du régime alimentaire à différents stades de la vie de l'insecte [1, 2]. Pour compenser le manque d'un nutriment particulier, les insectes peuvent les acquérir par une alimentation supplémentaire, par exemple sur la boue, divers excréments et sécrétions de vertébrés, et la charogne, dans un processus appelé puddling [2]. Bien que principalement décrit pour diverses espèces de papillons et de papillons de nuit, la formation de flaques se produit également dans d'autres ordres d'insectes, où l'attraction et l'alimentation de ces types de ressources ont un effet significatif sur la forme physique et d'autres traits du cycle biologique [2, 4,5,6,7 ]. Le moustique du paludisme, Anopheles gambiae sensu lato (sl), se présente comme un adulte "sous-alimenté" [8], et, en tant que tel, la formation de flaques peut jouer un rôle important pour ses traits d'histoire de vie, mais c'est un comportement qui jusqu'à présent a été négligé. L'inclusion de la formation de flaques d'eau comme moyen d'améliorer l'apport en nutriments dans cet important vecteur nécessite une attention particulière, car cela peut avoir des conséquences épidémiologiques importantes.

En raison de faibles réserves caloriques héritées du stade larvaire et d'une faible efficacité d'utilisation du repas de sang [9], les moustiques femelles adultes responsables du paludisme sont limitées dans leur apport en azote. Femme An. gambiae sl compensent souvent cela en prenant des repas de sang supplémentaires [10, 11], exposant ainsi davantage de personnes au risque de contracter des maladies et exposant le moustique à un risque accru de prédation. Alternativement, les moustiques pourraient utiliser une alimentation supplémentaire sur les excrétions de vertébrés pour obtenir des composés azotés afin d'améliorer la condition physique et la mobilité de vol, comme cela a été démontré pour d'autres insectes [2]. À cet égard, l'attraction forte et différentielle de l'une des espèces sœurs au sein de l'An. gambiae sl, Anopheles arabiensis, à l'urine fraîche et vieillissante des bovins [12,13,14], est intrigante. Anopheles arabiensis est opportuniste dans sa préférence d'hôte et est bien connu pour s'associer et se nourrir de bétail. L'urine des bovins est une ressource riche en composés azotés, l'urée représentant 50 à 95 % de l'azote total de l'urine fraîche [15, 16]. Au fur et à mesure que l'urine des bovins vieillit, les microbes utilisent ces ressources, réduisant ainsi la complexité des composés azotés en 24 h [15]. Avec l'augmentation rapide de l'ammoniac, corrélée à la diminution de l'azote organique, les microbes alcalophiles, dont beaucoup produisent des composés toxiques pour les moustiques, se développent [15], ce qui peut être l'une des principales causes de la raison pour laquelle la femelle An. arabiensis sont préférentiellement attirés par les urines âgées de 24 h ou moins [13, 14].

Dans cette étude, An. arabiensis, au cours de leur premier cycle gonotrophique, ont été évalués pour savoir s'ils acquièrent des composés azotés, y compris l'urée, par formation de flaques d'urine. Ensuite, une série d'expériences ont été menées pour évaluer comment les moustiques femelles allouent cette ressource nutritive potentielle pour améliorer la survie, la reproduction et la poursuite de la recherche de nourriture. Enfin, l'odeur de l'urine de bétail fraîche et vieillissante a été évaluée pour déterminer si elle fournit des indices fiables pour la recherche d'un hôte et l'alimentation en sang d'An. arabiensis dans leur recherche de cette ressource nutritive potentielle, et les corrélats chimiques sous-jacents à l'attraction différentielle observée ont été identifiés. Le mélange d'odeurs synthétiques de composés organiques volatils (COV) identifié dans l'urine âgée de 24 h a été évalué plus avant dans des conditions de terrain, développant les résultats obtenus dans des conditions de laboratoire et démontrant l'efficacité de l'odeur d'urine de bétail pour attirer les moustiques de différents états physiologiques. Les résultats obtenus confirment qu'An. arabiensis acquiert et répartit les composés azotés trouvés dans l'urine des vertébrés pour affecter les traits d'histoire de vie. Ces résultats sont discutés dans le contexte des conséquences épidémiologiques potentielles et comment ceux-ci peuvent être utilisés pour la surveillance et le contrôle des vecteurs.

Anopheles arabiensis (souche Dongola) ont été maintenus à 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % HR et à un cycle lumière/obscurité de 12 h 12. Les larves ont été élevées dans des plateaux en plastique (20 cm × 18 cm × 7 cm), remplis d'eau distillée et nourris avec de la nourriture pour poissons Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Les pupes ont été collectées dans des tasses de 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, SE) et transférées dans des cages Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, TW) pour que les adultes émergent. Les adultes ont reçu une solution de saccharose à 10% ad libitum jusqu'à 4 jours après la levée (dpe), moment auquel les femelles à la recherche d'un hôte ont reçu le régime immédiatement ou ont été affamées pendant la nuit avec accès à de l'eau distillée, avant les expériences, comme décrit dessous. Les femelles utilisées pour les expériences de tube de vol n'ont été affamées que pendant 4 à 6 h avec un accès ad libitum à l'eau. Pour préparer les moustiques nourris au sang pour les essais biologiques ultérieurs, 4 femelles dpe ont reçu du sang de mouton défibriné (Håtunalab, Bro, SE) à l'aide d'un système d'alimentation à membrane (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Royaume-Uni). Les femelles entièrement engorgées ont ensuite été transférées dans des cages séparées et ont reçu soit un régime directement, comme décrit ci-dessous, soit un accès ad libitum à 10 % de saccharose pendant 3 jours, avant les expériences décrites ci-dessous. Ces dernières femelles ont été utilisées pour les essais biologiques en tube de vol et ont été transférées dans la salle d'expérimentation, puis affamées avec un accès ad libitum à de l'eau distillée 4 à 6 h avant les expériences.

Des tests d'alimentation ont été utilisés pour quantifier la consommation d'urine et d'urée par un adulte. femelles arabiensis. Des femelles à la recherche d'un hôte et nourries de sang ont reçu pendant 48 h des régimes contenant une dilution à 1 % d'urine de bovins frais et vieillis, diverses concentrations d'urée, ainsi que deux témoins, 10 % de saccharose et de l'eau. De plus, un colorant alimentaire (1 mg ml-1 xylène cyanole FF ; CAS 2650-17-1 ; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) a été ajouté au régime alimentaire et fourni dans une matrice 4 × 4 de tubes de microcentrifugation de 250 µl (Axygen Scientific, Union City, Californie, États-Unis ; Fig. 1A) remplie jusqu'au bord (environ 300 ul). Pour éviter la concurrence entre les moustiques et l'influence potentielle de la couleur du colorant, dix moustiques ont été placés dans de grandes boîtes de Petri (12 cm de diamètre, 6 cm de hauteur ; Semadeni, Ostermundigen, CH ; Fig. 1A) dans l'obscurité totale à 25 ± 2 °C et 65 ± 5 % HR. Ces expériences ont été répétées de 5 à 10 fois. Suite à l'exposition aux régimes alimentaires, les moustiques ont été placés à - 20 ° C jusqu'à une analyse plus approfondie.

Urine et urée de bovins absorbées par des femelles Anopheles arabiensis en recherche d'hôte et nourries de sang. Les moustiques femelles ont reçu des régimes alimentaires composés d'urine de bétail fraîche et vieillie, de diverses concentrations d'urée, de saccharose (10 %) et d'eau distillée (H2O) dans un test d'alimentation (A). Les femelles à la recherche d'un hôte (B) et nourries au sang (C) ont absorbé de plus grands volumes de saccharose que tous les autres régimes testés. Notez que les femelles à la recherche d'un hôte ont absorbé moins d'urine de bovins âgés de 72 h que d'urine de bovins âgés de 168 h (B). La teneur moyenne en azote total de l'urine (± écart-type) est représentée dans l'encart. L'urée a été absorbée par les femelles à la recherche d'un hôte (D, F) et nourries au sang (E, G) de manière dose-dépendante. Le volume moyen imbibé (D, E) avec différentes désignations de lettres sont significativement différents les uns des autres (analyse de variance unidirectionnelle avec une analyse post hoc de Tukey ; p < 0,05). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (B–E). Les droites pointillées représentent les droites de régression log-linéaire (F, G)

Pour libérer le régime imbibé, les moustiques ont été placés individuellement dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml contenant 230 µl d'eau distillée, et les tissus ont été rompus à l'aide d'un pilon jetable et d'un moteur sans fil (VWR International, Lund, SE), puis centrifugés à 10 krpm pendant 10 min. Les surnageants (200 µl) ont été transférés dans une microplaque à 96 puits (Sigma-Aldrich) et l'absorbance (λ620 nm) déterminée à l'aide d'un lecteur de microplaque basé sur un spectrophotomètre (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE). Alternativement, les moustiques ont été broyés dans 1 ml d'eau distillée, dont 900 µl ont été transférés dans une cuvette pour analyse spectrophotométrique (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Pour quantifier le régime imbibé, une courbe standard a été préparée par une dilution en série résultant en une plage de 0,2 µl à 2,4 µl de 1 mg ml-1 xylène cyanol. Ensuite, la densité optique des concentrations de colorant connues a été utilisée pour déterminer le volume de nourriture absorbée par chaque moustique.

Les données volumétriques ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie d'une comparaison par paires post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Une analyse de régression linéaire a décrit l'apport d'urée dépendant de la concentration et des comparaisons ont été faites entre les réponses des moustiques à la recherche d'un hôte et nourris au sang (GraphPad Prism v8.0.0 pour Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US).

Environ 20 µl d'échantillon d'urine de chaque catégorie d'âge ont été liés sur Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) et enfermés dans des capsules en étain (8 mm × 5 mm). La capsule a été insérée dans une chambre de combustion d'un analyseur CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US) pour déterminer la teneur en azote de l'urine fraîche et vieillissante, selon le protocole du fabricant. L'azote total (g N l−1) a été quantifié sur la base des concentrations connues d'urée utilisées comme standard.

Pour évaluer l'effet du régime alimentaire sur la survie des femelles à la recherche d'un hôte et nourries de sang, les moustiques ont été placés individuellement dans de grandes boîtes de Petri (diamètre 12 cm, hauteur 6 cm; Semadeni), avec un trou recouvert de filet dans le couvercle (3 cm diamètre) pour la ventilation et l'alimentation. Les régimes, constitués d'une dilution à 1 % d'urine de bovin frais et vieilli, de quatre concentrations d'urée, ainsi que de deux témoins, 10 % de saccharose et d'eau, ont été fournis directement après 4 jpe. Chaque régime a été pipeté sur des rouleaux de coton dentaire (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) insérés dans des seringues de 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), avec le piston retiré, puis placés sur les boîtes de Pétri (Fig. 1A). Les régimes ont été remplacés quotidiennement. La salle expérimentale a été entretenue comme décrit ci-dessus. Les moustiques survivants ont été comptés deux fois par jour, tout en éliminant les moustiques morts, jusqu'à la mort du dernier moustique (n = 40 par traitement). La survie des moustiques se nourrissant des régimes respectifs a été analysée à l'aide des courbes de survie de Kaplan-Meyer et des statistiques de test de log-rank pour la comparaison de la distribution de survie entre les régimes (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).

Un moulin à moustiques sur mesure, basé sur Attisano et al. [17], était constitué de panneaux acryliques transparents de 5 mm d'épaisseur (10 cm L × 10 cm L × 10 cm H) dépourvus de panneaux avant et arrière (Fig. 3 : haut). Un assemblage de pivot, avec un tube vertical construit à partir d'une colonne de chromatographie en phase gazeuse (0,25 mm id; 7,5 cm L) collé à des broches d'insectes aux deux extrémités, a été suspendu entre une paire d'aimants en néodyme, distants de 9 cm. Un tube horizontal fait du même matériau (6,5 cm de long) coupait en deux le tube vertical et créait un bras d'attache et un bras qui portait un petit morceau de papier d'aluminium comme signal d'interruption de la photo.

Avant l'attache, les femelles affamées de 24 h ont eu accès aux régimes décrits ci-dessus pendant 30 min. Des moustiques femelles entièrement nourries ont ensuite été anesthésiées individuellement sur de la glace pendant 2 à 3 minutes et collées sur une épingle à insectes à l'aide de cire d'abeille (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) sur leur mésothorax, puis attachées au bras du tube horizontal de le moulin à vol. Chaque révolution de vol a été enregistrée par un enregistreur de données personnalisé, puis stockée et affichée à l'aide du logiciel PC-Lab 2000™ (v4.01 ; Velleman, Gavere, BE). Le moulin à vol a été placé dans une pièce climatisée (12 h : 12 h, clair : sombre, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % HR).

Pour visualiser le modèle d'activité de vol, la distance totale parcourue (m) et le nombre total d'épisodes d'activité de vol continue ont été calculés chaque heure au cours d'une période de 24 h. De plus, la distance moyenne parcourue par une femme individuelle a été comparée entre les différents traitements et analysée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle suivie d'une analyse post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), dans laquelle la distance moyenne était considérée comme une variable dépendante, tandis que les traitements étaient les facteurs indépendants. De plus, le nombre moyen d'épisodes a été calculé par incréments de 10 minutes.

Pour évaluer l'effet du régime alimentaire sur les performances de reproduction d'An. arabiensis, six femelles (4 dpe) ont été transférées dans des cages Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) directement après le gavage, puis ont reçu des régimes expérimentaux, comme décrit ci-dessus, pendant 48 h. Les régimes ont ensuite été retirés et des gobelets de ponte (30 ml; Nolato Hertila), remplis de 20 ml d'eau distillée, ont été fournis le troisième jour et mis à disposition pendant 48 h, en remplaçant les gobelets toutes les 24 h. Chaque régime alimentaire a été répété 20 à 50 fois. Les œufs ont été comptés et enregistrés pour chaque cage expérimentale. Un sous-échantillon d'œufs a été utilisé pour évaluer la taille moyenne et la variation entre les longueurs des œufs individuels (n ≥ 200 par régime) à l'aide d'un microscope Dialux-20 (DM1000 ; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) équipé d'une caméra Leica (DFC 320 R2 ; Leica Microsystem Ltd, DE). Les œufs restants ont été maintenus dans une chambre climatisée dans des conditions d'élevage standard pendant 24 h, et un sous-échantillon de larves de 1er stade récemment apparues (n ≥ 200 par régime) a été mesuré, comme ci-dessus. Le nombre d'œufs, ainsi que la taille des œufs et des larves, ont été comparés entre les différents traitements et analysés à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle suivie d'une analyse post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc. .).

Les substances volatiles de l'espace de tête provenant d'urines fraîches (1 h après l'échantillonnage), âgées de 24 h, 72 h et 168 h ont été recueillies à partir d'échantillons prélevés sur des bovins zébus, race Arsi. Pour des raisons de commodité et de disponibilité, les prélèvements d'échantillons d'urine ont été effectués tôt le matin alors que les bovins étaient encore dans l'étable. Des échantillons d'urine ont été prélevés sur dix individus, avec 100 à 200 ml de chaque échantillon transférés dans des sacs de torréfaction en polyamide séparés (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) placés dans un seau en plastique de chlorure de polyvinyle de 3 l avec un couvercle. Les volatils de l'espace de tête de chaque échantillon d'urine de bovin individuel ont été collectés directement (frais) ou après maturation pendant 24 h, 72 h et 168 h à température ambiante, c'est-à-dire que chaque échantillon d'urine était représenté dans chacun des groupes d'âge.

Pour la collecte des volatils de l'espace de tête, un système en boucle fermée a été utilisé, en faisant circuler un flux d'air filtré au charbon actif (100 ml min−1) à travers le sac en polyamide sur une colonne d'adsorbant, à l'aide d'une pompe à vide à membrane (KNF Neuberger, Freiburg, DE) , pendant 2,5 heures. À titre de contrôle, la collecte de l'espace de tête à partir d'un sac en polyamide vide a été effectuée. La colonne d'adsorbant était constituée d'un tube en téflon (5, 5 cm × 3 mm de diamètre intérieur) contenant 35 mg de Porapak Q (maille 50/80; Waters Associates, Milford, MA, États-Unis) entre des bouchons en laine de verre. Les colonnes ont été rincées avec 1 ml de n-hexane redistillé (Merck, Darmstadt, DE) et 1 ml de pentane (solvant pur à 99,0 % qualité GC, Sigma Aldrich) avant utilisation. Les matières volatiles adsorbées ont été éluées avec 400 ul de pentane. Les collections d'espace de tête ont été regroupées puis stockées à -20 ° C jusqu'à leur utilisation pour d'autres analyses.

Réponses comportementales d'An à la recherche d'un hôte et nourri au sang. arabiensis aux extraits volatils de l'espace de tête recueillis à partir d'urine fraîche, âgée de 24 h, 72 h et 168 h, ont été analysés à l'aide d'un olfactomètre à tube de verre droit [18]. Les expériences ont été menées pendant la période d'activité maximale de recherche d'hôte, ZT 13 -15, d'An. arabiensis [19]. L'olfactomètre à tube de verre (80 cm × 9,5 cm id) a été éclairé par une lumière rouge du dessus à 3 ± 1 lx. Un courant d'air filtré au charbon de bois et humidifié (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % d'humidité relative) a traversé le bioessai à 30 cm s−1. L'air passait à travers une série de tamis à mailles en acier inoxydable pour générer un flux laminaire et une structure de panache homogène. Des distributeurs de rouleaux de coton dentaire (4 cm × 1 cm ; L:D ; DAB Dental AB), suspendus à une bobine de fil de 5 cm à l'extrémité au vent de l'olfactomètre, ont été utilisés et le stimulus remplacé toutes les 5 min. Pour l'analyse, 10 μl de chaque extrait d'espace de tête, à une dilution de 1:10, ont été utilisés comme stimulus. Une quantité équivalente de pentane a été utilisée comme témoin. Des moustiques individuels à la recherche d'un hôte ou nourris au sang ont été placés dans des cages de libération séparées 2 à 3 h avant le début des expériences. La cage de libération a été placée à l'extrémité sous le vent de l'olfactomètre et les moustiques ont été autorisés à s'acclimater pendant 1 minute avant que la vanne papillon de la cage ne soit ouverte pour leur libération. L'attirance pour le traitement ou le contrôle a été analysée comme la proportion de moustiques qui sont entrés en contact avec la source dans les 5 minutes après leur libération. Chaque extrait volatil et contrôle de l'espace de tête a été répliqué au moins 30 fois, et pour éviter tout effet de jour, le même nombre de traitements et de contrôles a été testé chaque jour expérimental. Réponses d'An à la recherche d'un hôte et nourri au sang. arabiensis aux collections d'espace de tête ont été analysées à l'aide d'une régression logistique nominale suivie de comparaisons par paires des rapports de cotes (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).

La réponse de ponte d'An. arabiensis aux extraits d'espace libre d'urine de bovins frais et âgés a été analysé dans des cages Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Des gobelets en plastique (30 ml; Nolato Hertila) remplis de 20 ml d'eau distillée ont fourni le substrat de ponte et ont été placés dans des coins opposés de la cage, à 24 cm d'intervalle. La coupelle de traitement a été conditionnée avec 10 μl de chaque extrait d'espace de tête, à une dilution de 1:10. Une quantité équivalente de pentane a été utilisée pour conditionner la coupelle témoin. Les gobelets de traitement et de contrôle ont été échangés entre chaque expérience pour contrôler les effets de localisation. Dix femelles nourries de sang ont été relâchées dans les cages expérimentales à ZT 9–11, et le nombre d'œufs dans les coupelles a été compté après 24 h. Un indice de ponte a été calculé par : (nombre d'œufs pondus dans les godets de traitement – ​​nombre d'œufs pondus dans les godets témoins)/(nombre total d'œufs). Chaque traitement a été répété 8 fois.

Analyses combinées par chromatographie en phase gazeuse et détection électroantennographique (GC-EAD) d'An. arabiensis ont été réalisées comme décrit précédemment [20]. En bref, un Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, US), équipé d'une colonne HP-5 (30 m × 0,25 mm id, 0,25 μm d'épaisseur de film, Agilent Technologies), a été utilisé pour séparer les extraits volatils de l'espace de tête frais et l'urine âgée. L'hydrogène a été utilisé comme phase mobile à un débit linéaire moyen de 45 cm s−1. Chaque échantillon (2 μl) a été injecté en mode splitless, pendant 30 s, à une température d'injecteur de 225 °C. La température du four GC a été programmée de 35 ° C (3 min de maintien) à 10 ° C min-1 à 300 ° C (10 min de maintien). Au séparateur d'effluent GC, 4 psi d'azote ont été ajoutés et divisés 1: 1 dans un croisement à quatre voies à faible volume mort Gerstel 3D / 2 (Gerstel, Mülheim, DE) entre le détecteur à ionisation de flamme et l'EAD. Le capillaire d'effluent GC pour l'EAD a traversé une ligne de transfert Gerstel ODP-2, qui a suivi la température du four GC plus 5 ° C, dans un tube de verre (10 cm × 8 mm), où il a été mélangé avec du charbon de bois filtré, humidifié d'air (1,5 l min−1). L'antenne était placée à 0,5 cm de la sortie de ce tube. Chaque moustique individuel représentait une seule répétition, et au moins trois répétitions ont été effectuées pour chaque âge des échantillons d'urine, pour les moustiques à la recherche d'un hôte.

Les composés bioactifs dans les collections d'espace libre d'urine de bovins frais et vieillis, provoquant une réponse antennaire dans les analyses GC-EAD, ont été identifiés à l'aide d'un spectromètre combiné GC-MS (GC-MS ; 6890 GC et 5975 MS ; Agilent Technologies), exploité en mode d'ionisation par impact électronique à 70 eV. Le GC était équipé d'une colonne capillaire en silice fondue revêtue HP-5MS UI (60 m × 0,25 mm id, 0,25 μm d'épaisseur de film), et l'hélium a été utilisé comme phase mobile à un débit linéaire moyen de 35 cm s-1. Un échantillon de 2 μl a été injecté en utilisant les mêmes paramètres d'injecteur et températures de four que pour l'analyse GC-EAD. Les composés ont été identifiés en fonction de leurs temps de rétention (indices de Kovát) et de leurs spectres de masse, en comparaison avec des bibliothèques sur mesure et NIST14 (Agilent). Les composés identifiés ont été confirmés par l'injection d'étalons authentiques (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S2). Pour la quantification, de l'acétate d'heptyle (10 ng, 99,8 % de pureté chimique, Aldrich) a été injecté comme étalon externe.

Évaluer l'efficacité des mélanges d'odeurs synthétiques, composés des composés bioactifs identifiés dans l'urine fraîche et vieillie, pour attirer les An en quête d'hôte et nourris au sang. arabiensis, le même olfactomètre et le même protocole ont été utilisés comme décrit ci-dessus. Les mélanges synthétiques imitaient la composition et le rapport des composés dans les extraits volatils de l'espace de tête regroupés d'urine fraîche, âgée de 24 h, 48 h, 72 h et 168 h (Fig. 5D – G; Fichier supplémentaire 1: Tableau S2). Pour l'analyse, 10 μl d'une dilution au 1:100 des mélanges entièrement synthétiques, à des taux de libération globaux allant d'environ 140 à 2 400 ng h-1, ont été utilisés pour évaluer l'attraction des moustiques à la recherche d'un hôte et nourris au sang. Ensuite, des mélanges soustractifs, dans lesquels des composés uniques du mélange complet ont été éliminés, ont été testés par rapport au mélange complet. Réponses d'An à la recherche d'un hôte et nourri au sang. arabiensis aux mélanges synthétiques et soustractifs ont été analysés à l'aide d'une régression logistique nominale suivie de comparaisons par paires des rapports de cotes (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).

Pour évaluer si l'urine de bovin sert d'indice d'habitat hôte pour les moustiques porteurs du paludisme, de l'urine de bovin fraîche et vieillie, collectée comme ci-dessus, ainsi que de l'eau, ont été placées dans des seaux de 3 l (100 ml) recouverts de filet, avec des perforations latérales, et mis au-dessus des pièges à leurres hôtes (version BG-HDT ; BioGents, Regensburg, DE). Les dix pièges ont été placés à 50 m l'un de l'autre dans un pâturage, distant de 400 m d'une communauté villageoise (Sile, Éthiopie, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) et dépourvu de bétail, situé entre le site de reproduction permanent et le village. Cinq pièges ont été chauffés pour simuler la présence d'un hôte, tandis que cinq pièges sont restés non chauffés. La position de chaque traitement a été alternée chaque nuit pour un total de cinq nuits. Des comparaisons entre le nombre de moustiques capturés dans des pièges appâtés avec différents âges de l'urine ont été effectuées à l'aide d'une régression logistique avec une distribution bêta binomiale (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).

L'efficacité du mélange synthétique d'odeur d'urine de bovin de 24 h pour attirer les moustiques sauvages sur le terrain a été évaluée dans un village où le paludisme est endémique près de la ville de Meki dans la région d'Oromia en Éthiopie (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E ; figure 6A). L'étude a été menée entre la mi-août et la mi-septembre avant la pulvérisation annuelle à effet rémanent des habitations, en conjonction avec la grande saison des pluies. Cinq paires de maisons (espacées de 20 à 50 m), situées à la périphérie du village ont été sélectionnées pour l'étude (Fig. 6A). Les critères utilisés pour sélectionner les maisons étaient les suivants : aucun animal n'était autorisé à être gardé à l'intérieur des maisons, aucune cuisine (fumage du bois de chauffage ou du charbon de bois) n'était autorisée à l'intérieur (au moins pendant la période d'essai), et les maisons avec un maximum de deux habitants, dormant sous une moustiquaire non imprégnée d'insecticide. L'approbation éthique a été obtenue auprès du Comité d'examen de l'éthique de la recherche institutionnelle, Collège des sciences naturelles (CNS-IRB), Université d'Addis-Abeba (IRB/022/2016), conformément aux directives énoncées dans la Déclaration d'Helsinki de l'Association médicale mondiale. Le consentement de chaque chef de ménage a été obtenu avec l'aide d'agents de vulgarisation sanitaire. L'ensemble du processus a été approuvé par l'administration locale au niveau du district et du quartier (« kebele »). La conception expérimentale a suivi une conception en carré latin 2 × 2, dans laquelle le mélange synthétique et le contrôle ont été attribués à des maisons jumelées la première nuit et échangés entre les maisons la nuit expérimentale suivante. Cette procédure a été répétée dix fois. De plus, pour estimer l'activité des moustiques dans les maisons sélectionnées, des pièges CDC, sans distributeurs de mélange synthétique, ont été réglés pour fonctionner aux mêmes heures de la journée, au début, au milieu et à la fin des essais sur le terrain pendant cinq nuits.

Le mélange synthétique, contenant les six composés bioactifs dans leur rapport naturel (7: 9: 156: 156: 1: 4; Fig. 5D – G; Fichier supplémentaire 1: Tableau S2) a été dissous dans de l'heptane (solvant à 97,0% de qualité GC, Sigma Aldrich), et libéré à 140 ng h−1 à l'aide de distributeurs de mèches en coton [20]. Les distributeurs de mèche permettent la libération de tous les composés dans des proportions constantes tout au long de l'expérience de 12 h. L'heptane a été utilisé comme témoin. Les flacons ont été suspendus à côté du point d'entrée d'un piège lumineux du Center for Disease Control and Prevention (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, États-Unis; Fig. 6A). Les pièges étaient suspendus entre 0,8 et 1 m au-dessus du sol à côté du pied d'un lit avec un volontaire dormant sous une moustiquaire non traitée et opérés entre 18h00 et 06h30. Les moustiques capturés ont été triés par sexe et état physiologique (à jeun, nourris, semi-gravides et gravides [21]. Par la suite, les moustiques ont été identifiés morphologiquement à l'espèce [9, 22] et placés dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml avec du gel de silice sec. Cinq % des moustiques morphologiquement identifiés comme An. gambiae sl ont ensuite été dépistés en utilisant une analyse par réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour identifier le membre du complexe d'espèces [23]. études sur le terrain, les captures de pièges des maisons jumelées ont été analysées à l'aide d'un modèle d'ajustement logistique nominal, dans lequel l'attraction était la variable dépendante et le traitement (mélange synthétique vs témoin) l'effet fixe (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Ici, nous rapportons le χ2 et la valeur p du test du rapport de vraisemblance.

Pour évaluer si An. arabiensis sont capables d'acquérir de l'urine, et sa principale source d'azote, l'urée, par alimentation directe, les femelles post-émergence (dpe) à la recherche d'un hôte et nourries de sang ont eu accès à ces régimes sur une période de 48 h dans un test d'alimentation (Fig. 1A). Les femelles à la recherche d'un hôte et nourries au sang ont absorbé des volumes de saccharose significativement plus importants que n'importe lequel des autres régimes ou de l'eau (F(5 426) = 20,15, p < 0,0001 et F(5 299) = 56,00, p < 0,0001, respectivement ; Fig. 1B, C). De plus, les femelles à la recherche d'un hôte se nourrissaient moins d'urine âgée de 72 h que d'urine âgée de 168 h (Fig. 1B). Lorsqu'elles ont reçu des régimes contenant de l'urée, les femelles à la recherche d'un hôte ont absorbé un volume significativement plus important d'urée à 2, 69 mM par rapport à toutes les autres concentrations et à l'eau, sans différer de 10% de saccharose (F (10 813) = 15, 72, p <0, 0001; Fig. 1D ). Cela différait de la réponse des femelles nourries au sang, qui buvaient généralement des volumes significativement plus importants de régimes contenant de l'urée par rapport à l'eau, bien que buvant des volumes significativement plus petits par rapport au saccharose à 10 % (F(10,557) = 78,35, p <0,0001 ; Fig. 1E). De plus, lors de la comparaison entre les deux états physiologiques, les femelles nourries de sang ont absorbé plus d'urée à la concentration la plus faible que leurs homologues à la recherche d'un hôte, tandis que ces femelles ont absorbé des quantités similaires à des concentrations plus élevées (F(1,953) = 78,82, p <0,0001 ; Fig. .1F, G). Alors que le volume d'apport des régimes contenant de l'urée semblait avoir un optimum (Fig. 1D, E), les femelles des deux états physiologiques étaient capables de réguler la quantité d'urée imbibée sur toute la gamme des concentrations d'urée dans un log-linéaire. mode (Fig. 1F, G). De même, les moustiques semblent contrôler leur consommation d'azote en régulant le volume d'urine imbibé, car la quantité d'azote dans l'urine se reflète dans le volume imbibé (Fig. 1B, C et B en médaillon).

Pour évaluer le rôle de l'urine et de l'urée sur la survie des moustiques à la recherche d'un hôte et nourris au sang, les femelles ont été nourries avec les quatre âges d'urine (fraîche, 24 h, 72 h et 168 h après la déposition) et une gamme d'urée concentrations, ainsi que sur de l'eau distillée et 10% de saccharose comme témoins (Fig. 2A). Cette analyse de survie a révélé que le régime alimentaire avait un impact significatif sur le taux de survie global des femelles en quête d'hôte (urine : χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001 ; urée : χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001 ; Fig. . 2B, C) et femelles nourries au sang (urine : χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001 ; urée : χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001 ; Fig. 2D, E). Dans toutes les expériences, les femelles se nourrissant d'urine, d'urée et d'eau avaient une survie significativement réduite par rapport à celles recevant du saccharose comme alimentation (Fig. 2B – E). Les femelles à la recherche d'un hôte se nourrissant d'urine fraîche et âgée présentaient une survie différentielle, celles se nourrissant d'urine âgée de 72 h (p = 0, 016) ayant la probabilité de survie la plus faible (Fig. 2B). De plus, les femelles à la recherche d'un hôte nourries avec de l'urée 135 mM ont survécu plus longtemps que le contrôle de l'eau (p <0, 04) (Fig. 2C). Les femelles nourries au sang ont survécu plus longtemps lorsqu'elles ont été nourries avec de l'urine fraîche et âgée de 24 h par rapport à l'eau (p = 0,001 et p = 0,012, respectivement; Fig. 2D), tandis que celles nourries avec de l'urine âgée de 72 h ont survécu moins longtemps que celles nourries. sur des urines fraîches et âgées de 24 h (p < 0,0001 et p = 0,013, respectivement ; Fig. 2D). Lorsqu'elles sont nourries avec de l'urée 135 mM, les femelles nourries au sang ont survécu plus longtemps que toutes les autres concentrations d'urée et d'eau (p <0, 013; Fig. 2E).

Survie d'Anopheles arabiensis femelles en quête d'hôte et gorgées de sang nourries d'urine et d'urée de bovins. Les moustiques femelles ont reçu des régimes alimentaires composés d'urine de bétail fraîche et vieillie, de diverses concentrations d'urée, de saccharose (10 %) et d'eau distillée (H2O) dans un essai biologique (A). La survie des moustiques individuels en quête d'hôte (B, C) et nourris au sang (D, E) a été enregistrée toutes les 12 h, jusqu'à ce que toutes les femelles se nourrissent d'urine (B, D) et d'urée (C, E), ainsi que les témoins, saccharose et eau, étaient morts

La distance globale et le nombre d'épisodes, tels que déterminés dans un test d'usine de vol sur une période de 24 h, différaient entre les moustiques à la recherche d'un hôte et les moustiques nourris au sang, les moustiques nourris au sang affichant globalement moins d'activité de vol (Fig. 3). Les moustiques à la recherche d'hôtes recevant de l'urine fraîche et âgée, ou du saccharose et de l'eau, présentaient des schémas de vol variables (Fig. 3), les femelles nourries d'urine fraîche étant plus actives à l'aube, tandis que celles nourries d'urine âgée de 24 h et 168 h affichant activité majoritairement diurne. Les moustiques femelles recevant soit du saccharose soit de l'urine âgée de 72 h ont démontré une activité tout au long de la période de 24 h, tandis que ceux qui ont reçu de l'eau étaient plus actifs au milieu de la scotophase. Les moustiques nourris au saccharose ont démontré les niveaux d'activité les plus élevés tard dans la nuit et tôt le matin, tandis que ceux qui ont absorbé de l'urine âgée de 72 h ont diminué leur activité de manière constante au cours des 24 h (Fig. 3).

Performances de vol d'Anopheles arabiensis femelles en recherche d'hôte et gorgées de sang nourries d'urine et d'urée de bovins. Des moustiques femelles nourries avec des régimes composés d'urine de bétail fraîche et vieillie, de diverses concentrations d'urée, de saccharose (10%) et d'eau distillée (H2O) ont été attachées à un bras horizontal à rotation libre dans un test de moulin à vol (en haut). La distance globale et le nombre d'épisodes parcourus par heure sur 24 h (scotophase : gris ; photophase : blanc) ont été enregistrés pour chaque régime alimentaire pour les femelles à la recherche d'un hôte (à gauche) et nourries au sang (à droite). La distance moyenne et le nombre moyen d'épisodes sont indiqués à droite des diagrammes d'activité diurne. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. Voir le texte principal pour l'analyse statistique

En général, les épisodes globaux d'activité de vol par les femelles à la recherche d'un hôte ont suivi un schéma similaire à celui de la distance parcourue au cours de la période de 24 h. Le régime imbibé a affecté de manière significative la distance moyenne parcourue (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), les femelles à la recherche d'un hôte ayant imbibé de l'urine âgée de 72 h volant sur des distances significativement plus longues que tous les autres régimes (p < 0,0001), et les moustiques nourris au saccharose parcourant de plus longues distances que ceux nourris avec de l'urine fraîche (p = 0,022) et âgée de 24 h (p = 0,022). Contrairement aux modèles d'activité de vol décrits pour les régimes d'urine, les femelles à la recherche d'un hôte nourries à l'urée ont démontré une activité de vol continue au cours de la période de 24 h avec un pic d'activité au cours de la seconde moitié de la scotophase (Fig. 3). Alors que le schéma d'activité était similaire, les femelles à la recherche d'un hôte nourries à l'urée augmentaient significativement la distance moyenne parcourue en fonction de la concentration absorbée (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Les femelles à la recherche d'un hôte se nourrissant de n'importe quelle concentration d'urée testée parcouraient de plus longues distances que celles nourries avec de l'eau ou du saccharose (p < 0,03).

L'activité de vol globale des moustiques nourris au sang était stable et continue sur la période de 24 h pour tous les régimes, avec une augmentation de l'activité dans la seconde moitié de la scotophase pour les femelles nourries avec de l'eau ainsi que celles nourries avec de l'eau fraîche et âgée de 24 h. urine (Fig. 3). Alors que le régime à base d'urine affectait de manière significative la distance moyenne parcourue par les femelles nourries au sang (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), les régimes à base d'urée n'avaient aucun effet perceptible (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) . Seules les femelles gorgées de sang nourries avec de l'urine âgée de 24 h ont affiché une distance de vol moyenne accrue par rapport aux autres régimes d'urine et de contrôle (frais, p = 0,0091 ; 72 h, p = 0,0022 ; 168 h, p = 0,001 ; saccharose, p = 0,0017 ; dH2O, p = 0,036).

L'effet de l'urine et de l'urée sur les paramètres de reproduction a été évalué dans un essai biologique de ponte (Fig. 4A) et étudié en termes de nombre d'œufs pondus par femelle, ainsi que de la taille des œufs et des larves de premier stade nouvellement écloses. Le nombre d'œufs pondus par An. les femelles arabiensis nourries d'urine variaient selon le régime alimentaire (F (5, 222) = 4, 38, p = 0, 0008; Fig. 4B). Les femelles nourries avec de l'urine âgée de 24 h, après le repas de sang, ont pondu beaucoup plus d'œufs que lorsqu'elles étaient nourries avec d'autres régimes à base d'urine, et similaires à celles pondues par celles nourries avec du saccharose (Fig. 4B). De même, la taille des œufs pondus par les femelles nourries d'urine différait en fonction du régime alimentaire (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), les femelles nourries d'urine et de saccharose âgées de 24 h pondant des œufs significativement plus gros que celles nourries d'eau. , tandis que les œufs de femelles nourries avec de l'urine âgée de 168 h étaient significativement plus petits (Fig. 4C). De plus, les régimes urinaires affectaient significativement la taille des larves (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), avec des larves significativement plus grosses émergeant des œufs pondus par les femelles qui se nourrissaient d'urine âgée de 24 h et 72 h que celles des œufs de femelles nourries à l'eau et nourries à l'urine âgées de 168 h (Fig. 4D).

Performances de reproduction des femelles Anopheles arabiensis nourries d'urine et d'urée de bovins. Moustiques femelles gorgées de sang nourries avec des régimes composés d'urine de bovin fraîche et vieillie, de diverses concentrations d'urée, de saccharose (10%) et d'eau distillée (H2O) sur une période de 48 h, puis placées dans un bioessai avec accès à une oviposition substrat pendant 48 h (A). Le nombre d'œufs (B, E), la taille des œufs (C, F) et la taille des larves (D, G) ont été significativement affectés par le régime alimentaire fourni (urine de bovin : B–D ; urée : E–G). La moyenne de chaque paramètre mesuré avec différentes désignations de lettres est significativement différente l'une de l'autre (analyse de variance unidirectionnelle avec analyse post hoc de Tukey ; p < 0,05). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne

En tant que principal composant azoté de l'urine, l'urée, lorsqu'elle est proposée comme alimentation aux femelles nourries au sang, affecte de manière différentielle et significative tous les paramètres de reproduction étudiés. Le nombre d'œufs pondus par les femelles nourries à l'urée, après le repas de sang, différait selon la concentration d'urée (F(11, 360) = 4,69 ; p < 0,0001), les femelles nourries avec des concentrations d'urée comprises entre 134 µM et 1,34 mM pondant plus d'œufs (Fig. 4E). Les femelles nourries avec des concentrations d'urée égales ou supérieures à 134 µM ont pondu des œufs plus gros que celles nourries avec de l'eau (F(10, 4245) = 36,7 ; p < 0,0001 ; Fig. 4F), tandis que la taille des larves, bien qu'affectée par des concentrations similaires d'urée imbibée par la mère (F(10, 3305) = 37,9 ; p < 0,0001), était plus variable (Fig. 4G).

L'attraction globale pour les extraits volatils de l'espace de tête de l'urine de bovin d'An. arabiensis, telle qu'évaluée dans un olfactomètre à tube de verre (Fig. 5A), était significativement affectée par l'âge de l'urine (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032 ; Fig. 5B). Une analyse post-hoc a révélé que l'odeur d'urine âgée de 24 h provoquait un niveau d'attraction significativement plus élevé par rapport à tous les autres traitements (72 h : p = 0,0060, 168 h : p = 0,012, pentane : p = 0,00070), à l'exception de l'odeur d'urine fraîche (p = 0,13 ; figure 5B). Bien qu'il n'y ait pas de différence significative dans l'attirance globale pour l'odeur d'urine par les moustiques nourris au sang (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067 ; Fig. 5C), ces femelles se sont avérées significativement plus attirées par l'extrait volatil de l'espace de tête. d'urine âgée de 72 h par rapport au témoin (p = 0,0066; Fig. 5C).

Réponse comportementale d'Anopheles arabiensis à la recherche d'un hôte et nourri au sang à l'odeur naturelle et synthétique de l'urine de bétail. Schéma de l'olfactomètre à tube de verre (A). Attraction vers les extraits volatils de l'espace de tête d'urine de bétail fraîche et vieillie de moustiques à la recherche d'un hôte (B) et nourris au sang (C). Les réponses antennaires d'An. arabiensis à des extraits d'espace de tête fractionnés à partir d'urine de bovins âgés de 24 h (E), 72 h (F) et 168 h (G) sont présentés. Les traces de détection électroantennographique (EAD) montrent des changements de tension en réponse aux composés bioactifs dans l'espace de tête éluant du chromatographe en phase gazeuse et détectés par le détecteur à ionisation de flamme (FID). La barre d'échelle indique l'amplitude de la réponse (mV) par rapport au temps de rétention (s). L'identité et le taux de libération (µg h-1) des composés bioactifs sont indiqués. Un seul astérisque (*) indique des réponses cohérentes de faible amplitude. Les doubles astérisques (**) indiquent des réponses non reproductibles. Chercheur d'hôte (H) et nourri au sang (I) An. arabiensis sont différemment attirés par les mélanges synthétiques d'odeurs d'urine de bovins frais et vieillis. La proportion moyenne de moustiques attirés avec différentes désignations de lettres sont significativement différentes les unes des autres (analyse de variance unidirectionnelle avec une analyse post hoc de Tukey ; p < 0,05). Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la proportion

Femme An. arabiensis, 72 h et 120 h post-repas de sang, n'ont pas montré de préférence pour les extraits volatils de l'espace de tête des urines fraîches et vieillies de bovin par rapport au témoin au pentane lors de la ponte (χ2 = 3,07, p > 0,05 ; Fichier complémentaire 1 : Fig .S1).

Pour la femelle An. arabiensis, les analyses GC-EAD et GC – MS ont identifié huit, six, trois et trois composés bioactifs dans les extraits volatils de l'espace de tête d'urine de bovin fraîche, âgée de 24 h, 72 h et 168 h, respectivement (Fig. 5D – G). Malgré la différence observée dans le nombre de composés provoquant une réponse électrophysiologique, la majorité de ces composés étaient présents dans chacun des extraits volatils de l'espace de tête collectés à partir d'urine fraîche et vieillie. Ainsi, seuls les composés qui ont produit des réponses physiologiques supérieures au seuil des antennes femelles, pour chaque extrait, ont été inclus dans les analyses ultérieures.

Le taux de libération volatil total des composés bioactifs dans les collections d'espace de tête est passé de 29 µg h−1 dans l'urine fraîche à 242 µg h−1 dans l'urine âgée de 168 h, principalement en raison de l'augmentation du p- et du m-crésol, ainsi que sous forme de phénol. En revanche, le taux de libération d'autres composés, par exemple le 2-cyclohexène-1-one et le décanal, a diminué avec l'âge de l'urine, en corrélation avec la diminution observée de l'intensité du signal (abondance) dans le chromatogramme (Fig. 5D -G panneau de gauche) et dans la réponse physiologique à ces composés (Fig. 5D-G panneau de droite).

Dans l'ensemble, les mélanges synthétiques se rapprochant du rapport naturel des composés bioactifs identifiés dans les extraits volatils de l'espace de tête d'urine fraîche et vieillie (Fig. 5D – G), ne semblaient pas susciter une attraction significative dans la recherche d'hôte (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083 ; Fig. 5H) ou chez des moustiques nourris au sang (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30 ; Fig. 5I). Cependant, une comparaison post hoc par paires entre les traitements a révélé une attraction significative des moustiques à la recherche d'un hôte pour le mélange synthétique d'urine âgée de 24 h, par rapport au témoin au pentane (p = 0, 0086; Fig. 5H).

Pour évaluer le rôle des composants individuels dans le mélange synthétique d'urine âgée de 24 h, six mélanges soustractifs, à partir desquels des composés individuels ont été retirés, ont été évalués par rapport au mélange complet dans un test en tube en Y. Pour les moustiques à la recherche d'un hôte, la soustraction de composés individuels du mélange complet a eu un effet significatif sur la réponse comportementale (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032 ; Fichier supplémentaire 1 : Fig S2A), tous les mélanges soustractifs étant moins attrayants que le mélange complet. En revanche, l'élimination des composés individuels du mélange synthétique complet n'a pas affecté la réponse comportementale des moustiques nourris au sang (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), à l'exception du décanal, qui a entraîné une réduction du niveau d'attraction par rapport au mélange complet (p = 0,022 ; Fichier complémentaire 1 : Fig. S2B).

L'efficacité du mélange synthétique d'urine de bovins âgés de 24 h pour attirer les moustiques dans des conditions de terrain a été évaluée pendant dix nuits dans un village rural endémique de paludisme en Éthiopie (Fig. 6A). Au total, 4861 moustiques ont été capturés et identifiés, dont 45,7% étaient des An. gambiae sl, 18,9% étaient Anopheles pharoensis et 35,4% étaient Culex spp. (Fichier complémentaire 1 : Tableau S1). Anopheles arabiensis était le seul membre de l'An. gambiae complexe d'espèces à identifier par analyse PCR. En moyenne, 320 moustiques ont été capturés par nuit, période pendant laquelle les pièges appâtés avec le mélange synthétique ont capturé plus de moustiques que les pièges appariés sans le mélange (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Au cours de chacune des cinq nuits de contrôle au début, au milieu et à la fin de l'essai, des pièges non appâtés ont été posés. Des nombres similaires de moustiques ont été capturés dans chaque piège apparié, démontrant qu'il n'y avait pas de biais entre les maisons (χ2 (0, 1665) = 9 × 10–13, p > 0,05) sans déclin de la population au cours de la période d'étude. Il y avait un nombre significativement plus élevé de moustiques capturés dans les pièges contenant le mélange synthétique par rapport aux pièges témoins : à la recherche d'un hôte (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), récemment nourris de sang (χ2(0, 650) = 32,2 , p < 0,0001) et gravide (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123 ; Fichier complémentaire 1 : Tableau S1). Cela s'est également reflété dans le nombre total de moustiques capturés : à la recherche d'un hôte > nourris au sang > gravides > semi-gravides > mâles.

Évaluation sur le terrain de l'efficacité du mélange d'odeurs d'urine de bovin synthétique de 24 h. Les essais sur le terrain ont été effectués dans le centre-sud de l'Éthiopie (carte), à ​​proximité de la ville de Meki (encart), à l'aide de pièges lumineux des Centres de contrôle des maladies (CDC) (à droite) dans des maisons jumelées en utilisant une conception en carré latin (carte aérienne) (A ). Les pièges lumineux CDC appâtés avec l'odeur synthétique attiraient et capturaient différemment la femelle Anopheles arabiensis (B), mais pas Anopheles pharoensis (C), un effet qui dépendait de l'état physiologique. De plus, les pièges ont capturé un nombre significativement plus élevé de Culex spp. (D) par rapport aux témoins. Les barres de gauche représentent les indices de choix moyens des moustiques capturés dans des pièges appâtés appariés (vert) et témoins (ouverts) (N = 10), tandis que les barres de droite représentent les indices de choix des moustiques capturés dans des pièges témoins appariés (ouverts ; N = 5). Les astérisques indiquent le niveau de signification statistique (*p = 0,01 et ***p < 0,0001)

Les trois espèces ont été capturées de manière différentielle dans les pièges contenant le mélange synthétique. Un nombre significativement plus élevé de demandeurs d'accueil (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), nourris par le sang (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) et gravides (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) Un. arabiensis ont été capturés dans des pièges libérant le mélange synthétique (Fig. 6B), alors qu'aucune différence dans le nombre d'An. pharoensis, à différents états physiologiques, a été trouvé (Fig. 6C). Pour les Culex spp., seul le nombre de moustiques à la recherche d'hôtes s'est avéré significativement plus élevé dans les pièges appâtés avec le mélange synthétique (χ2(1, 1319) = 12,6, p = 0,0004 ; Fig. 6D), par rapport aux piège de contrôle.

Des pièges à leurres hôtes, situés loin des hôtes potentiels entre le site de reproduction et une communauté villageoise rurale en Éthiopie, ont été utilisés pour évaluer si les moustiques responsables du paludisme utilisent l'odeur d'urine de bétail comme indice de l'habitat de l'hôte. En l'absence du signal de l'hôte, de la chaleur, aucun moustique n'a été capturé, avec ou sans présence d'odeur d'urine de bovin (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S3). Cependant, en présence à la fois de chaleur et d'odeur d'urine de bétail, les femelles moustiques responsables du paludisme ont été attirées et capturées, bien qu'en faible nombre, quel que soit l'âge de l'urine (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13 ; Fichier complémentaire 1 : Fig. S3). En revanche, le contrôle de l'eau n'a attrapé aucun moustique du paludisme en présence de chaleur (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S3).

Les moustiques du paludisme acquièrent et allouent des composés azotés par une alimentation compensatoire sur l'urine de bétail, c'est-à-dire la formation de flaques, pour améliorer les traits d'histoire de vie, similaires à ceux d'autres insectes [2, 4, 24,25,26]. L'urine de bétail est une ressource facilement disponible et renouvelable trouvée en étroite association avec les sites de repos, par exemple, les étables et la végétation haute à proximité des ménages ruraux et des sites de ponte, pour les vecteurs du paludisme. Les moustiques femelles localisent cette ressource par l'olfaction et sont capables de réguler l'absorption de composés azotés dans l'urine, y compris le principal constituant azoté de l'urine, l'urée [15, 16]. Selon l'état physiologique du moustique femelle, les nutriments contenus dans l'urine sont alloués pour améliorer l'activité de vol et la survie des femelles à la recherche d'un hôte, ainsi que les traits de survie et de reproduction chez les individus nourris au sang au cours de leur premier cycle gonotrophique. En tant que tel, la formation de flaques d'urine joue un rôle nutritif important pour les vecteurs du paludisme qui se referment en tant qu'adultes sous-alimentés [8], en fournissant aux moustiques femelles la capacité d'obtenir des composés azotés vitaux en s'engageant dans une alimentation à faible risque. Cette découverte a des conséquences épidémiologiques importantes, car les femelles augmentent leur espérance de vie, leur activité et leur rendement reproducteur, ce qui affecte la capacité vectorielle. De plus, ce comportement pourrait être ciblé dans les futurs programmes de gestion des vecteurs.

Le profil COV de l'urine change avec l'âge en raison de l'activité microbienne [15, 27,28,29]. Femme à la recherche d'un hôte An. arabiensis sont attirés par les COV de l'urine fraîche et âgée de 24 h (cette étude, [12, 13]), ce qui est différent de celui trouvé pour d'autres diptères, y compris les glossines et les tabanidés, qui préfèrent les COV de l'urine plus âgée [27, 30 , 31]. La complexité globale des COV augmente avec le vieillissement de l'urine, le phénol et les dérivés phénoliques étant les COV prédominants (cette étude, [27, 32]). Alors que les mélanges de COV phénoliques sont suffisants pour susciter l'attraction chez les glossines et les tabanidés [30,31,32,33], ils ne le font pas chez An. arabiensis, corroboré par Mahande et al. [13] et Kweka et al. [12]. En revanche, les mélanges de COV détectés par antenne qui attirent la femelle An. arabiensis sont plus complexes. Ces mélanges contiennent également du phénol, du p- et du m-crésol, bien qu'à des taux de libération inférieurs à ceux trouvés dans l'urine plus ancienne. Un mélange synthétique de ces composés phénoliques, ainsi que trois COV actifs sur les antennes supplémentaires, est nécessaire pour récapituler la réponse comportementale des femelles à la recherche d'un hôte à l'urine de bétail dans des conditions de laboratoire. Cela suggère une fonction conservée au cours de l'évolution des composés phénoliques chez les diptères, mais le contexte dans lequel ces composés phénoliques sont présentés est adaptatif pour différentes espèces. Lorsqu'il a été évalué dans des conditions de terrain, le même mélange a suscité l'attraction d'An. arabiensis et Culex spp. femelles, mais pas d'An. pharoensis, mettant l'accent sur une réponse conservée, mais dépendante de l'espèce. Il a été proposé que les COV d'urine de bovins agissent comme des indices d'habitat hôte, c'est-à-dire des attractifs à longue distance qui indiquent la présence d'un hôte potentiel dans une zone particulière, pour les glossines, les tabanidés et d'autres mouches non culicidés [34]. Les moustiques, cependant, ne semblent pas utiliser l'urine de bétail comme signal d'habitat hôte, ce qui met l'accent sur une fonction écologique différente chez les Culicidae (moustiques) et les mouches non Culicidae.

Tandis que l'odeur synthétique de l'urine âgée de 24 h attirait les An récemment nourris de sang et gravides. arabiensis au champ, cela n'a pas été observé en laboratoire. En revanche, les femelles nourries au sang ont montré une forte attirance pour l'air humide de fond, avec peu ou pas d'effet des COV de l'urine de bétail. Ces résultats comportementaux en laboratoire sont probablement confondus par le fait que l'humidité elle-même est un puissant attractif de préoviposition [35], mais est une condition préalable au bioessai. L'urine de bovins a été proposée pour réguler la ponte des moustiques gravides [14], mais cela n'a pas été pris en charge dans cette étude. Bien que l'urine de bovin puisse ne pas stimuler la ponte, on ne peut exclure que les moustiques gravides s'imbibent de l'urine déposée dans ou à côté des sites de ponte. Comme la ponte n'était pas affectée par l'urine de bovin, d'autres explications plausibles de l'attirance des moustiques pour l'urine de bovin ont été évaluées.

L'urine fraîche contient principalement des sels et des composés azotés, deux classes de nutriments fréquemment recherchés par les insectes utilisant une alimentation complémentaire pour augmenter leur forme physique [2]. Chercheur d'hôte et nourri de sang An. arabiensis s'imbibent activement d'urine de bovins, à un niveau similaire à la consommation d'eau, quel que soit l'âge de l'urine, ce qui peut être dû à des niveaux globaux similaires d'azote dans l'urine fraîche et vieillie. Au fur et à mesure que l'urine des bovins vieillit, les microbes utilisent les composés azotés de l'urine, en particulier l'hydrolyse de l'urée en ammoniac, ce qui entraîne une complexité changeante des communautés microbiennes [15]. Alors que les femelles ne manifestent aucune préférence alimentaire évidente pour l'urine fraîche ou vieillie, les moustiques démontrent une réponse dose-dépendante à l'urée, révélant que les moustiques à la recherche d'un hôte et nourris au sang régulent leur consommation de composés azotés. Les moustiques à la recherche d'hôtes s'imprègnent d'une large gamme de concentrations d'urée. Cependant, ces femelles affichent des volumes d'apport d'urée optimaux à des concentrations similaires à celles présentes dans l'urine de bovins frais et âgés de 24 h [15, 16], et qui ne diffèrent pas du témoin saccharose. Alors que les moustiques nourris au sang absorbent des volumes d'urée et d'eau inférieurs à ceux des femelles à la recherche d'un hôte, comme les femelles récemment nourries au sang sont contraintes par le repas précédent, ces femelles affichent un seuil de réponse à l'urée plus bas. Les moustiques sont incapables de métaboliser l'urée et utilisent probablement des bactéries intestinales qui possèdent des uréases pour hydrolyser l'urée en ammoniac [36, 37]. Les tissus de l'intestin moyen et les corps adipeux des moustiques sont capables de convertir l'ammoniac en acides aminés, glutamate, glutamine, alanine et proline [38, 39], qui sont des composants importants des protéines du jaune et, dans le cas de la proline, peuvent être utilisés comme source d'énergie pour le vol [40].

Les schémas d'allocation des nutriments azotés assimilés à partir de l'urine, y compris l'urée, ne sont pas indépendants, car ces nutriments sont alloués en fonction de l'état physiologique à la survie, au vol et à la reproduction afin de fournir les traits d'histoire de vie démontrés dans la recherche d'hôte et nourris au sang. les moustiques. Ceci est conforme à l'aspect général de l'allocation des nutriments trouvé pour d'autres insectes, dans lequel les traits d'histoire de vie sont limités par un ou plusieurs nutriments limitants [1, 2]. La nécessité d'allouer des nutriments à plus d'un trait en même temps peut générer des compromis physiologiques entre ces traits [1], comme démontré par paires pour la recherche d'hôte (vol vs survie) et nourri au sang ( survie vs reproduction) moustiques. Il a été démontré que la nécessité d'augmenter l'acquisition d'un type d'aliment contenant un nutriment limitant entraîne une consommation excessive de nutriments nuisibles à un autre objectif d'allocation [1, 41]. De tels compromis peuvent expliquer pourquoi les moustiques femelles à la recherche d'un hôte sont attirées et s'imbibent d'urine âgée de 72 h, qui contient un microbiote toxique [15], augmentant la distance parcourue mais entraînant une durée de vie considérablement réduite. D'autre part, l'acquisition, par les femelles gorgées de sang, d'un excès de nutriments dans l'urine âgée de 24 h, permet d'affecter ces ressources à plus d'un trait, à savoir la survie, le vol et la reproduction. Cela démontre que l'alimentation compensatoire à base d'urine peut être utilisée à des fins similaires à celles de plusieurs repas de sang au cours d'un cycle gonotrophique [42]. Ce cadre d'allocation [1, 3] fournit une compréhension mécaniste des modèles d'histoire de vie et de la manière dont les ressources sont allouées à la survie, à la dispersion et à la reproduction.

Une alimentation compensatoire des composés azotés, sous forme de repas sanguins multiples, a été mise en évidence chez An. gambiae sl soit nécessaire au développement des œufs chez les femelles à faibles réserves ténérales, soit pour améliorer le nombre et l'état des œufs se développant au cours d'un seul cycle gonotrophique [43,44,45,46]. Cependant, l'alimentation sanguine est risquée et présente un compromis pour la femelle entre la reproduction et la survie [47], faisant d'une autre source à faible risque de composés azotés, par exemple l'urine de bovin, une alternative adaptative. L'augmentation de la survie, ainsi que l'augmentation du nombre et de la taille des œufs pondus après un repas compensatoire d'urine ou d'urée par une femelle nourrie au sang reflète ce qui est observé après plusieurs repas de sang [43, 45, 46]. Ceci suggère qu'An. arabiensis peut minimiser le compromis entre le besoin de ressources azotées pour améliorer les traits de reproduction et la survie en utilisant l'urine de bovin.

Les moustiques nourris au sang allouent l'essentiel des composés azotés de l'alimentation compensatoire à la reproduction, et en partie à la survie, tandis que les moustiques à la recherche d'un hôte les utilisent principalement pour alimenter le vol [48], analogue à celui décrit pour d'autres insectes [49, 50]. . L'augmentation immédiate et soutenue de l'activité de vol par les femelles à la recherche d'un hôte après un repas d'urée suggère que cette ressource peut être utilisée directement pour alimenter l'activité de vol, potentiellement grâce à l'utilisation de la combinaison de la conversion décrite précédemment de l'ammoniac en proline [39] et son oxydation supplémentaire de la proline pour alimenter les muscles de vol [40, 48]. Le modèle d'activité de l'aube démontré par les femelles à la recherche d'un hôte nourries d'urine fraîche reflète celui observé pour An. gambiae se livrant à une alimentation sanguine compensatoire [10]. Les femelles à la recherche d'un hôte nourries avec de l'urine âgée de 24 h et 168 h, d'autre part, démontrent une activité anormale tout au long de la photophase, ce qui suggère que ces femelles peuvent être à la recherche de nutriments pendant cette période. L'alimentation avec de l'urine âgée de 72 h a entraîné des schémas d'activité similaires à ceux démontrés après l'alimentation à l'urée, reflétant les niveaux élevés d'ammoniac présents dans l'alimentation à ce moment, en raison de l'activité microbienne [15]. Ainsi, les moustiques ont la capacité d'utiliser l'urine de bovin, et son principal composant azoté, l'urée, comme carburant pour voler.

Les moustiques porteurs du paludisme démontrent des stratégies comportementales et physiologiques complexes pour s'adapter à leur environnement. Se nourrir d'urine de bovins compense la nécessité de prendre plusieurs repas de sang en améliorant les traits d'histoire de vie d'une manière dépendante de l'état. Cela est susceptible d'affecter la capacité vectorielle en augmentant la probabilité de survie quotidienne et la densité des vecteurs, tout en diminuant l'interaction entre le vecteur et l'hôte, en réduisant le besoin de plusieurs repas de sang. La question de savoir si les insecticides et les médicaments antiparasitaires administrés aux bovins sont présents dans l'urine des bovins et affectent ainsi négativement le gain de traits d'histoire de vie au vecteur, ou accélèrent le développement de la résistance à ces traitements, nécessite une enquête plus approfondie. Les repas d'urine fournissent une source alternative d'azote, non sanguine, et réduisent le nombre de femelles sous-alimentées nécessitant un repas pré-sanguin pour l'énergie métabolique avant le développement des œufs. D'autres études sont nécessaires pour évaluer si la propension à se nourrir d'urine et ses effets sont différemment affectés par l'âge, en particulier pour les femmes plus âgées, qui peuvent transmettre le parasite à l'homme. De plus, il est nécessaire d'analyser l'effet de ce régime sur la survie et le développement du parasite du paludisme. L'alimentation compensatoire à base d'urine de bovins ou d'autres ressources riches en azote devrait être prise en compte dans les futurs modèles de capacité vectorielle. À cette fin, d'autres études sont nécessaires pour établir le rôle naturel de l'urine de bétail dans l'alimentation des vecteurs du paludisme, et comment ce comportement peut être manipulé dans les futures stratégies de gestion des vecteurs. En tant que telle, l'odeur synthétique d'urine de bétail développée ici peut être utilisée, par exemple, dans des interventions de piégeage de masse, au niveau local ou régional, pour la lutte contre les vecteurs du paludisme.

Toutes les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses fichiers supplémentaires.

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Les auteurs remercient également le Dr Elsa Quillery pour son aide dans l'analyse PCR des moustiques collectés sur le terrain, et Yared Debebe pour son aide dans les expériences HDT.

Financement en libre accès fourni par l'Université suédoise des sciences agricoles. Nous remercions le Conseil suédois de la recherche (VR/2014-3331) pour le financement de cette étude.

Département des sciences zoologiques, Université d'Addis-Abeba, PO. Boîte postale 1176, Addis-Abeba, Éthiopie

Mengistu David & Habte Tekie

Département de biologie, Université Debre Berhan, PO. Boîte postale 445, Debre Berhan, Éthiopie

Mengistu Dawit

Unité d'écologie chimique, Département de biologie de la protection des plantes, Université suédoise des sciences agricoles, Alnarp, Suède

Mengistu Dawit, Sharon R. Hill, Göran Birgersson & Rickard Ignell

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RI et SRH ont conçu l'étude. MDB a collecté des données. MDB et SRH ont réalisé les analyses statistiques. GB, HT, SRH et RI ont supervisé l'étude. MDB, SRH et RI ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Rickard Ignell.

L'approbation éthique a été obtenue auprès du Comité d'examen de l'éthique de la recherche institutionnelle, Collège des sciences naturelles (CNS-IRB), Université d'Addis-Abeba (IRB/022/2016), conformément aux directives énoncées dans la Déclaration d'Helsinki de l'Association médicale mondiale. Le consentement de chaque chef de famille a été obtenu avec l'aide d'agents de vulgarisation sanitaire et approuvé par l'administration locale au niveau du district et du 'Kebele'.

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Tableau S1. Espèce, sexe et état gonotrophique des moustiques capturés dans des pièges lumineux CDC appâtés avec le mélange d'odeurs synthétiques d'urine de bovin âgé de 24 h ou de contrôle à l'heptane. Tableau S2. Composés synthétiques utilisés pour les analyses électrophysiologiques et comportementales. Figure S1. Les Anopheles arabiensis nourris au sang ne montrent aucune préférence de ponte pour les extraits volatils de l'espace de tête d'urine de bovins frais et vieillis. Les désignations de lettres n'indiquent aucune différence significative les unes par rapport aux autres (analyse de variance unidirectionnelle avec analyse post hoc de Tukey ; p > 0,05). Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la proportion. Figure S2. Réponses comportementales d'Anopheles arabiensis à la recherche d'hôte (A) et nourri au sang (B) aux mélanges synthétiques complets et soustractifs d'urine de bovins âgés de 24 h. La suppression de composants uniques du mélange synthétique (cercles ouverts) a affecté de manière différentielle et significative la réponse des femelles des deux états physiologiques. Différentes lettres minuscules indiquent des différences significatives déterminées par une analyse de variance unidirectionnelle suivie d'une analyse post hoc de Dunnett (p < 0,05). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de proportion. Figure S3. L'urine de bétail améliore les captures des pièges à leurres hôtes uniquement en présence du signal de l'hôte, la chaleur. Les pièges leurres-hôtes n'attrapaient les moustiques porteurs du paludisme que dans un pâturage désert entre le site de reproduction et le village en présence à la fois de chaleur et d'urine de bétail (fraîche ou vieillie), mais pas seuls. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne.

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Réimpressions et autorisations

Dawit, M., Hill, SR, Birgersson, G. et al. Les moustiques du paludisme acquièrent et répartissent l'urine de bétail pour améliorer les traits d'histoire de vie. Malar J 21, 180 (2022). https://doi.org/10.1186/s12936-022-04179-6

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Reçu : 07 janvier 2022

Accepté : 10 mai 2022

Publié: 11 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1186/s12936-022-04179-6

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