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Nov 03, 2023

L'impact de certains facteurs abiotiques sur le processus d'éclosion d'Artemia à travers de vrais

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 6370 (2023) Citer cet article

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Les études actuelles sur les impacts abiotiques sur Artemia, un crustacé largement utilisé en aquaculture, et l'écotoxicologie, se concentrent souvent sur l'analyse des paramètres (p. ex., taux d'éclosion, survie). Ici, nous démontrons qu'une compréhension mécaniste peut être obtenue grâce à la mesure de la consommation d'oxygène en temps réel sur une période de temps prolongée dans une plate-forme microfluidique. La plate-forme permet un contrôle de haut niveau du microenvironnement et une observation directe des changements morphologiques. À titre de démonstration, la température et la salinité sont choisies pour représenter des paramètres abiotiques critiques également menacés par le changement climatique. Le processus d'éclosion d'Artemia se compose de quatre étapes différentes : hydratation, différenciation, émergence et éclosion. Il a été démontré que différentes températures (20, 35 et 30 ° C) et salinités (0, 25, 50 et 75 ppt) modifient considérablement la durée des étapes d'éclosion, les taux métaboliques et l'éclosion. Plus précisément, la reprise métabolique des kystes d'artémias dormants était significativement améliorée à des températures plus élevées et à une salinité modérée, cependant, le temps nécessaire à cette reprise ne dépendait que des températures plus élevées. L'éclosion était inversement proportionnelle à la durée du stade de différenciation de l'éclosion, qui persistait plus longtemps à des températures et des salinités plus basses. L'approche actuelle d'investigation du métabolisme et des changements physiques correspondants peut être utilisée pour étudier les processus d'éclosion d'autres espèces aquatiques, même celles à faible taux métabolique.

La concentration croissante de gaz à effet de serre causée par l'activité anthropique modifie le climat mondial, et l'un des résultats immédiats est une température ambiante plus élevée1,2,3. Les océans du monde entier, agissant comme des puits de chaleur, absorbent la majeure partie de cette chaleur4,5. L'expansion thermique des océans résultant de l'augmentation de la teneur en chaleur, ainsi que de la fonte des glaciers, produit une augmentation du volume des océans, qui a un effet direct sur la salinité de l'eau océanique6,7 qui est encore exacerbée par les changements dans le cycle global de l'eau8,9 . Les effets des variations de ces paramètres sur la reproduction et la santé peuvent influencer l'abondance et la répartition des différentes espèces aquatiques. Les mécanismes d'action précis de différents facteurs environnementaux changeants, tels que les facteurs abiotiques10,11 et les substances toxiques environnementales12,13 sur la réponse phénotypique de diverses espèces ont été étudiés. Ici, nous visons à obtenir une compréhension mécaniste des impacts des changements dans l'environnement abiotique sur le processus d'éclosion d'Artemia, communément appelée crevette de saumure, grâce à une surveillance en temps réel. Artemia est un aliment vivant populaire utilisé en aquaculture en raison de sa densité nutritionnelle élevée, de sa facilité de culture et de sa taille relativement petite, ce qui rend cette espèce optimale pour faciliter l'alimentation des larves marines avec une petite ouverture buccale14,15. Il est également largement utilisé comme organisme modèle dans les études biochimiques, physiologiques, génétiques, écologiques et écotoxicologiques16,17,18. Malgré le fait que les artémias vivent dans un environnement hypersalin qui est leur seul mécanisme de défense contre les prédateurs19,20, la compréhension mécaniste des effets des facteurs abiotiques sur le processus d'éclosion des artémias peut potentiellement fournir des informations sur les effets de la modification de la température et de la salinité sur le éclosion d'autres crustacés largement répandus dans le milieu marin, tels que les copépodes.

Les femelles d'Artemia développent un kyste de diapause sans activité métabolique détectable pendant le mode de reproduction d'oviparité (diapause endogène)21. À ce stade de dormance, les kystes peuvent être déshydratés par séchage à l'air ou élimination osmotique de l'eau, moment auquel les kystes sont au repos et peuvent survivre jusqu'à 28 ans22. Le métabolisme des kystes peut être repris - et l'éclosion initiée - lorsque les conditions environnementales sont favorables23, les principaux paramètres environnementaux abiotiques affectant l'éclosion étant la température et la salinité de l'eau17,24,25. Un certain nombre d'études antérieures ont étudié l'impact de ces paramètres environnementaux abiotiques sur l'éclosion d'Artemia26,27,28,29,30,31, cependant, l'évaluation a été limitée à la mesure du taux d'éclosion au point final de l'expérience. Par exemple, Kumar et al. ont observé que les performances d'éclosion optimales d'Artemia se produisaient à 29 °C et 29 parties pour mille (ppt) de salinité26 tandis que Sharahi et al. ont trouvé que les conditions optimales étaient de 27–28 °C et 35 ppt, respectivement30. Hassan et al. ont montré que la proportion maximale d'Artemia éclos lorsque la salinité et la température étaient de 30 ppt et 24 °C, respectivement, et que le taux d'éclosion diminuait lorsque la température montait de 24 à 32 °C alors que la salinité variait entre 20 et 40 ppt27. Ahmed et al. ont rapporté que la salinité optimale pour l'éclosion est de 20 ppt31. Dans une autre étude réalisée par Bahr et al. sur l'influence de la salinité sur l'éclosion, l'éclosion optimale a été trouvée à des salinités de 60 ppt et des températures autour de 30 °C28. La variation des paramètres optimaux pourrait être due à des différences dans les paramètres de test (par exemple, l'exposition à la lumière25,30,32) ou à la variation des conditions environnementales (taille du récipient, gradients de température/salinité dans les milieux en vrac).

Ce travail vise à unifier les conditions environnementales et à étendre la compréhension des effets des paramètres abiotiques au-delà de la mesure finale du taux d'éclosion à une analyse mécaniste approfondie de leurs impacts sur le processus d'éclosion d'Artemia. Les quatre étapes distinctes de l'éclosion d'Artemia - (1) hydratation, (2) différenciation, (3) émergence et (4) éclosion33 peuvent être différenciées en fonction des changements morphologiques et du métabolisme34,35. Dans cette étude, nous avons intégré un capteur d'oxygène optique dans un "aquarium" microfluidique pour surveiller le taux de consommation d'oxygène, également appelé taux métabolique de routine36, en temps réel tout au long du processus d'éclosion, tandis qu'un microscope optique est utilisé pour capturer photomicrographies des kystes en éclosion à intervalles réguliers. Auparavant, le métabolisme des kystes d'Artemia37 et ceux d'autres petits crustacés tels que Acartia tonsa38,39 et Leptodora kindti40 ont été étudiés en utilisant différentes techniques de respirométrie. La taille relativement petite de la plate-forme microfluidique utilisée dans cette étude peut diminuer le rapport signal sur bruit41,42,43 du capteur d'oxygène et permettre la corrélation des données du capteur avec les données d'imagerie au microscope. La plate-forme peut également maintenir plus facilement des conditions environnementales uniformes44,45,46 en utilisant des contrôleurs programmables hors puce par rapport aux systèmes en vrac (tels que des béchers, des aquariums) utilisés dans les études contemporaines. Récemment, des plates-formes de laboratoire sur puce microfluidiques et millifluidiques ont été utilisées pour des applications pharmaceutiques, notamment des tests de médicaments sur des cellules47, des études biologiques sur des espèces telles que C. elegans48,49,50,51,52 et le poisson zèbre53,54,55. De plus, dans le présent travail, la précision de l'analyse du point final du taux d'éclosion est également améliorée grâce au transfert automatisé - minimisant la contamination et l'erreur humaine 56, 57, 58, 59 - de l'ensemble de l'échantillon testé vers une puce de comptage avec tamis - comme des structures qui peuvent être imagées dans leur intégralité et traitées avec une analyse d'image plutôt que de s'appuyer sur un échantillon par lots et des méthodes de comptage manuel.

Les kystes d'Artemia ont été achetés auprès de Brine Shrimp Direct et stockés à 4 ° C comme recommandé par le vendeur jusqu'à un jour avant les études d'éclosion, moment auquel ils ont été transférés à température ambiante pour permettre une adaptation progressive de la température. La figure 1A montre les images de microscopie électronique à balayage (SEM) (JEOL FS-100) des kystes d'artémias reçus. Les kystes ont une structure en forme de coupe et le diamètre de la structure circulaire de la coupe varie entre 180 et 260 µm.

Montage expérimental. (A) La microscopie électronique à balayage (SEM) montre la structure en forme de coupe des kystes d'Artemia tels que reçus à un grossissement de 450X. (B) Aperçu schématique de la plate-forme microfluidique pour étudier l'effet des paramètres environnementaux abiotiques sur les performances d'éclosion d'Artemia. (C) Puce d'éclosion avec capteur O2 intégré et sondes de température connectées (barre d'échelle = 5 mm) (La position du spot du capteur O2 est indiquée en encadré) (D) Puce de comptage avec des structures de type tamisage faites de micropiliers PDMS à la sortie (échelle barre = 10 mm) [Les kystes et les nauplii piégés au niveau des structures de tamisage sont indiqués en médaillon (barre d'échelle = 500 µm)].

Les études d'éclosion des kystes d'Artemia ont été réalisées sur une plate-forme microfluidique (Fig. 1B). La plate-forme consistait en une puce d'éclosion, qui a une chambre cylindrique (diamètre de 13 mm, hauteur de 3,55 mm) reliée à une entrée et une sortie (hauteur de 1,7 mm, largeur de 4 mm) (Fig. 1A supplémentaire). Le volume total de la puce d'éclosion est d'environ 563 µL. Des coins arrondis (filets) ont été incorporés à l'entrée et à la sortie pour s'assurer que les kystes n'étaient pas piégés dans les coins de la chambre lors de l'insertion au début de l'éclosion et du transfert des kystes et des nauplii à la fin de l'expérience. Le volume mort a été minimisé en simulant le débit de fluide dans ANSYS FLUENT (Fig. 1B supplémentaire). La figure 1C montre la chambre d'éclosion utilisée pour cette étude. La puce était composée de polydiméthylsiloxane (PDMS) et fabriquée en coulant du PDMS sur un moule (Fig. 1C supplémentaire) préparé à l'aide d'une imprimante 3D (MAX X-43, Asiga) et durci pendant une nuit à 60 ° C dans un four à convection par gravité (modèle : 10GC, Laboratoire Quincy). La puce d'éclosion a deux couches. La couche supérieure a les structures de chambre et de canal, et la couche inférieure est une dalle PDMS vierge. Les couches supérieure et inférieure de la puce d'éclosion ont été collées à l'aide d'un traitement corona (BD-20AC, ETP) et d'un chauffage ultérieur à 60 ° C pendant une nuit. Avant de coller les couches, plusieurs trous ont été pratiqués dans la couche supérieure à l'aide de poinçons de biopsie pour l'entrée, la sortie et les capteurs. Un spot de capteur O2 (OXSP5, Pyroscience) a été collé à la couche supérieure PDMS à l'intérieur de la chambre à l'aide de colle silicone (Spglue, Pyroscience). Une fibre optique a été connectée exactement derrière le spot du capteur O2 à travers un trou dans la puce PDMS. La fibre optique était connectée à un oxymètre optique externe (FireSting®-O2, Pyroscience). L'oxymètre était composé d'une diode électroluminescente (DEL) et d'une photodiode qui stimulent et détectent à la fois l'émission de luminescence dépendante de l'oxygène et mesurent la concentration en oxygène dissous de l'eau dans la chambre chaque seconde pendant l'éclosion. Une sonde de température (Pt100, Pyroscience) a également été connectée à la puce pour détecter la température de l'eau à l'intérieur de la puce et ainsi compenser les lectures de concentration en oxygène dissous pour toute fluctuation de température. Pour minimiser les variations, la puce a été placée au-dessus d'un film chauffant (PI film heater-24 V, Icstation) connecté à un contrôleur proportionnel-intégral-dérivé (PID) (6-30 V DC Electronic Thermostat Controller, DROK) qui contrôlait la température de l'eau à l'intérieur de la puce d'éclosion en fonction de la température de consigne (20, 25 et 30 °C). Un adaptateur d'alimentation CC à tension variable (ALP002, KEJIESHENG) a été utilisé pour alimenter le contrôleur PID, et une sonde thermocouple (TC 10K, QINGDAO) y a été connectée pour mesurer la température de l'eau à l'intérieur de la puce. Le contrôleur PID ajuste la puissance d'entrée en fonction de la mesure de la sonde pour maintenir une variation maximale de 0,1 °C par rapport à la température de consigne. La puce d'éclosion avec le chauffage intégré a été placée sous un microscope optique stéréo numérique (SE400-Z, Amscope) équipé d'un appareil photo numérique (MD500, Amscope) pour capturer une photomicrographie de la puce toutes les cinq minutes pendant l'éclosion. Pendant tout le processus d'éclosion, une lumière à diode électroluminescente (DEL) (1W, Amscope) a été maintenue allumée en continu en raison de son effet sur l'éclosion26,32.

Avant le début de l'expérience, l'eau d'éclosion a été préparée en ajoutant des quantités variables de sel marin disponible dans le commerce (Fluval Sea, pH : 8,1 à 8,2) à de l'eau déminéralisée (DIW) (préparée et filtrée (taille des pores du filtre = 200 nm ) à l'aide du système de purification d'eau Barnstead Smart2Pure, Thermo Scientific) pour produire de l'eau salée artificielle avec des salinités de 0, 25, 50 et 75 parties pour mille (ppt) qui ont été mélangées dans un tube à essai à l'aide d'un mélangeur vortex (Vortex genie 2, Scientific Industries) . Un mélange minutieux de la solution d'eau salée permet une distribution uniforme de l'oxygène dissous et du sel. Le poids des kystes d'Artemia a été mesuré à l'aide d'une balance numérique de précision (Bonvoisin) et mélangés soigneusement avec la solution d'eau salée de sorte que la concentration en kystes soit de 5 g/L. La solution de kyste a été immédiatement insérée à l'intérieur de la puce d'éclosion jusqu'à ce que la chambre soit remplie. L'entrée et la sortie de la puce ont ensuite été fermées à l'aide de tubes flexibles et de clips de reliure pour empêcher l'infiltration d'air à l'intérieur de la puce. Des expériences d'éclosion ont été menées pendant 24 h à partir du moment où les kystes ont été immergés dans les solutions salines. Les expériences d'éclosion ont été réalisées en triple pour chaque condition de température (20, 25 et 30 °C) et de salinité (0, 25, 50 et 75 ppt).

Les différents stades d'éclosion d'Artemia et la transition entre eux peuvent être identifiés par des changements dans l'épuisement de la concentration en oxygène dissous (DDOC) de l'eau dans la puce d'éclosion fermée en raison de la consommation d'oxygène par les kystes, telle que mesurée par le sur- capteur d'oxygène à puce et les photomicrographies prises par le microscope optique. Cela renseigne sur la consommation d'oxygène et la durée des différentes étapes d'éclosion. Les résultats de la consommation d'oxygène sont normalisés en tenant compte du taux de concentration en oxygène (ROC) à chaque stade car la valeur absolue et la durée des différents stades d'éclosion varient avec la température et la salinité. Le ROC peut également être considéré comme un taux métabolique standard comme mentionné dans la littérature36. Le ROC a été calculé à l'aide de la formule suivante

A chaque stade d'éclosion, la durée et le ROC correspondant ont été mesurés - à l'exception de certaines températures et salinités, pour lesquelles les stades d'émergence et d'éclosion n'étaient pas complets dans la période d'éclosion de 24 h (Voir "Effet de la salinité et de la température de l'eau sur la durée des différents stades d'éclosion").

La profondeur de la puce d'éclosion (3,55 mm) a été conçue pour s'assurer que le liquide de suspension avait suffisamment d'oxygène dissous pour l'éclosion et de l'espace pour que les nauplius puissent nager. Cette profondeur permettait plusieurs nauplii et kystes dans le même plan vertical, ce qui empêchait un comptage précis des nauplii et des kystes. Par conséquent, une puce de comptage (Fig. 1D) a été conçue avec une chambre de faible profondeur (800 µm) de sorte que les nauplii et les kystes étaient limités à une seule monocouche. La puce avait une entrée et une sortie. La sortie contenait des micropiliers PDMS qui agissaient comme des structures de type tamis (Fig. 1D en médaillon) et permettaient uniquement à l'eau de s'écouler à travers le canal, empêchant les nauplii et les kystes de la chambre de s'échapper. La puce avait deux couches: la couche supérieure avait une chambre, des structures de micropilier, une entrée et une sortie et était construite en PDMS coulé sur un moule imprimé en 3D (Fig. 2A supplémentaire). La couche inférieure était une dalle PDMS vierge. Les deux couches ont été liées en utilisant un traitement corona suivi d'un chauffage, comme décrit ci-dessus. À l'entrée et à la sortie de la puce de comptage, la hauteur est supérieure à celle de la chambre (1,7 mm contre 800 µm) et conçue avec un rayon de congé de 900 µm pour permettre un écoulement fluide du kyste et des nauplii d'Artemia à travers l'entrée et la sortie . La Fig. 2B supplémentaire affiche les résultats d'une simulation ANSYS Fluent de l'écoulement de fluide à travers la puce, démontrant l'absence de tout volume mort. Après 24 h, les nauplii éclos et les kystes éclos/non éclos dans la puce d'éclosion ont été transférés automatiquement sur la puce de comptage dans une solution de méthanol à 30 % à un débit de 100 µL/min par pompe à seringue (Pico plus 11 elite, Harvard Apparatus). La sortie de la puce d'éclosion et l'entrée de la puce de comptage étaient reliées par un tube en poly(tétrafluoroéthylène) (PTFE), et l'entrée de la puce d'éclosion est reliée à la seringue montée sur pousse-seringue via un tube Tygon flexible. Les nauplii d'Artemia nagent rapidement après l'éclosion et la solution de méthanol à 30 % dans DIW a été utilisée pour euthanasier les nauplii afin d'obtenir des images claires dans la puce de comptage. Un appareil photo numérique (D3100, Nikon) a été utilisé pour capturer des images des nauplii et des kystes présents dans la puce d'éclosion. Les images ont été traitées dans ImageJ où le nombre de kystes et de nauplii a été compté en fonction de leur circularité. Si un objet avait une circularité supérieure ou égale à 0,9, il était considéré comme un kyste (hachuré ou non), et tout objet de l'image avec une circularité inférieure (inférieure à 0,9) était considéré comme nauplii (Fig. 3). Le taux d'éclosion a été calculé à l'aide de la formule suivante

OriginPro (ver. 2022b, OriginLab) a été utilisé pour toutes les analyses statistiques. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± écart type. Comme mentionné précédemment dans "Taux de consommation d'oxygène et durée des différentes étapes", à certaines températures et salinités, les étapes d'émergence et d'éclosion ne se sont pas terminées en 24 h. Ainsi, pour ces étapes, la significativité des données a été déterminée à l'aide d'une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie d'un test post-hoc de Bonferroni. Cependant, pour les deux premières étapes (hydratation et différenciation) et le taux d'éclosion final, les données ont été obtenues à toutes les températures et salinités, et la signification des données au sein et entre les groupes a été déterminée à l'aide d'une ANOVA à deux voies avec le test post-hoc de Bonferroni. . Les tableaux ANOVA sont inclus dans le tableau supplémentaire 1. Avant d'effectuer les tests ANOVA, la normalité des données a été examinée à l'aide d'un graphique quantile-quantile normal avec un niveau de confiance de 95 %. L'analyse de la corrélation entre les différents résultats a été réalisée à l'aide du coefficient de corrélation de Pearson. Les données étaient considérées comme significatives dans toutes les analyses statistiques si p < 0,05.

Au fur et à mesure que les kystes d'Artemia éclosent, leur consommation d'oxygène et leur morphologie subissent des changements. Comme décrit dans la section méthodes, ces changements ont été enregistrés à l'aide d'un capteur d'oxygène sur puce et d'un microscope optique. La figure 2A représente des photomicrographies de divers stades d'éclosion. La figure 2B illustre l'épuisement de la concentration en oxygène dissous (DDOC) de l'eau à l'intérieur de la puce d'éclosion. Lorsqu'il y avait des kystes dans la puce d'éclosion, comme les kystes consommaient de l'oxygène tout au long du processus d'éclosion, la concentration d'oxygène dissous dans l'eau diminuait et donc le DDOC augmentait (ligne continue bleue). Le taux de consommation d'oxygène (ROC) à chaque étape, tel qu'estimé par Eq. (1), est également représenté sur la figure 2B (ligne continue verte). Lorsque la puce d'éclosion ne contenait que de l'eau salée artificielle mais pas de kystes (expérience de contrôle), le DDOC (ligne pointillée bleue) et le ROC (ligne pointillée verte) étaient presque négligeables. Il est important de noter que bien que le matériau de la puce d'éclosion PDMS soit perméable à l'oxygène60,61, la comparaison du DDOC avec des kystes dans la puce au DDOC sans kystes (témoin) indique que le taux de consommation d'oxygène à tous les stades est significativement plus élevé que perméation soutenant ainsi l'utilisation de la configuration actuelle pour comparer qualitativement le DDOC dans différentes conditions environnementales. Nous notons que puisque les kystes d'Artemia utilisés pour l'éclosion dans cette étude n'ont pas été stérilisés, il est possible qu'ils contiennent des micro-organismes qui consomment une partie de l'oxygène dissous. Les effets des kystes et la présence potentielle de micro-organismes sur le DDOC n'ont pas été distingués dans cette étude, et une enquête plus approfondie est nécessaire. Cependant, comme l'expérience de contrôle indique (lignes pointillées sur la figure 2B) des changements négligeables du DDOC sur la période de 24 heures, on peut conclure que ni la puce d'éclosion ni les micro-organismes potentiels dans l'eau salée artificielle elle-même n'ont contribué aux changements du DDOC. .

Photomicrographies et lectures du capteur d'O2 à différents stades d'éclosion. (A) Photomicrographie à différents stades d'éclosion obtenue à partir du stéréomicroscope optique (barre d'échelle = 500 µm). L'encart montre la morphologie des kystes/nauplii à différents stades (barre d'échelle = 100 µm). (B) Détection sur puce de l'épuisement de la concentration en oxygène dissous (DDOC) lorsqu'il y avait des kystes d'Artemia (ligne continue bleue) et aucun kyste (ligne pointillée bleue de contrôle) dans la puce d'éclosion à 25 ° C et 25 ppt. Le taux de consommation d'oxygène (ROC) à différents stades était représenté par des lignes vertes (ligne continue - avec kystes, ligne pointillée - contrôle). Les lignes en gras dans le graphique indiquent la moyenne et la zone ombrée indique l'écart type. Les triangles rouges en (B) représentent le DDOC aux moments correspondant aux photomicrographies présentées en (A).

L'immersion des kystes dans l'eau commence la phase d'hydratation, au cours de laquelle les kystes se gonflent et se développent en une forme sphérique (plutôt qu'en forme de coupe) [Fig. 2A(i)]. Au fur et à mesure que les kystes s'imbibent d'eau, le métabolisme énergétique, l'ARN et la synthèse des protéines commencent dans un court laps de temps34,62. Lorsque le métabolisme énergétique est réactivé, l'activité respiratoire augmente considérablement, comme en témoigne l'augmentation du ROC (Fig. 2B). A la fin de l'étape d'hydratation, la majorité des kystes sont de forme sphérique et la différenciation commence. De plus, à ce stade, il n'y a pas de division cellulaire ni d'augmentation de l'ADN34,62, ce qui entraîne un besoin en oxygène presque constant et faible et donc un ROC inférieur (Fig. 2B). Au troisième stade (émergence), la coquille du kyste commence à se fracturer en raison de l'augmentation de la pression de turgescence à l'intérieur résultant d'une quantité accrue de glycérol, et l'embryon commence à émerger de la coquille brisée dans une membrane d'éclosion [Fig. 2A(iii)]35. La phase d'émergence est très active et a besoin d'énergie supplémentaire, ce qui entraîne une augmentation du DDOC et du ROC (Fig. 2B). Enfin, au dernier stade (éclosion), les embryons d'Artemia quittent la coquille du kyste et la membrane d'éclosion et commencent à nager [Fig. 2A(iv)]. À ce stade, la demande en oxygène a de nouveau diminué, comme détecté par une diminution comparative du ROC (Fig. 2B).

La durée de chaque étape d'éclosion à différentes températures et salinités est présentée à la Fig. 3. Dans l'ensemble, nous notons qu'à la température la plus basse (20 °C) et/ou à la salinité la plus basse (0 ppt) de notre plage testée, le 24- h période de temps était insuffisante pour terminer l'éclosion en raison de la durée prolongée de chacune des trois premières étapes, à l'exception de 20 ° C à 25 ppt et 0 ppt à 30 ° C. Dans cette optique, la durée de la phase d'éclosion (définie comme le temps restant à la fin de la phase d'émergence) s'est avérée diminuer considérablement lorsque la salinité augmentait à 75 ppt à 25 et 30 °C. À 20 °C (où le stade d'éclosion a été observé à seulement 25 ppt de salinité), la durée du stade d'éclosion a été réduite de manière significative par rapport à celle à toutes les autres températures étudiées, quelle que soit la salinité.

Durée des différents stades d'éclosion à différentes salinités et températures de l'eau. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart type (n = 3). Dans chaque catégorie (hydratation et durée de l'étape de différenciation), les moyennes qui ne partagent pas la même lettre sont significativement différentes les unes des autres (ANOVA à deux facteurs avec test post-hoc de Bonferroni, p < 0,05). Les étapes d'éclosion qui n'étaient pas terminées dans les 24 h n'ont pas été analysées statistiquement et marquées par "nc". * et # indiquent des durées d'émergence et d'éclosion significativement différentes, respectivement, à une température par rapport aux autres températures testées (ANOVA unidirectionnelle avec test post-hoc de Bonferroni, p < 0,05). ** désigne une durée de stade d'éclosion significativement différente entre deux salinités testées différentes (ANOVA unidirectionnelle avec test post-hoc de Bonferroni, p <0,05).

Reconnaissant que pendant l'hydratation (barres vertes, Fig. 3), les kystes secs d'Artemia absorbent l'eau par osmose63, l'effet de la température et de la salinité peut être modélisé par la loi de Van't Hoff64

où Δπ est la différence de pression osmotique, R est la constante universelle des gaz, T est la température et ΔC est la différence des concentrations de soluté. À mesure que la température (T) augmente, le taux d'osmose augmente également, ce qui correspond à une diminution de la durée d'hydratation, comme illustré à la Fig. 3. La Fig. 4A supplémentaire montre la corrélation négative significative entre la durée d'hydratation et la température déterminée par la corrélation de Pearson. coefficient (r = - 0,9) et un ajustement linéaire entre ces paramètres (R2 = 0,99) (Fig. 4B supplémentaire). Dans le même temps, l'augmentation de la salinité de l'eau à n'importe quelle température peut diminuer la différence des concentrations de soluté interne et externe (ΔC) des kystes, ce qui devrait diminuer la pression osmotique avec une augmentation de la durée d'hydratation. Cependant, les résultats expérimentaux indiquent que les changements de la salinité n'affectent pas significativement la durée d'hydratation. En revanche, la durée de différenciation (barres bleues, Fig. 3) a diminué de manière significative lorsque la température a été augmentée ou la salinité a été augmentée de 0 à 25 ppt (ne varie pas significativement au-delà de 25 ppt) à n'importe quelle température, sauf 30 ° C. Pour comprendre cela, notons qu'à travers le stade de différenciation, le kyste atteint le stade d'émergence, lorsque la pression de turgescence croissante induite par la synthèse de glycérol à partir du tréhalose provoque le début de la fracture de la coquille. Une élévation de la température améliore la synthèse du glycérol63, ce qui raccourcit la période de différenciation. L'augmentation de la salinité augmente également le niveau de glycérol35 et peut diminuer la période de différenciation. Cependant, à mesure que la salinité de l'eau augmente, l'environnement externe devient hypertonique et il existe un risque de perte d'eau cellulaire due au processus d'exosmose, ce qui pourrait allonger la période de différenciation à une salinité plus élevée. La concurrence entre ces deux facteurs opposés pourrait expliquer pourquoi il n'y avait pas de différence significative dans la durée de l'étape de différenciation au-delà de 25 ppt de salinité. Fait intéressant, la durée de l'étape d'émergence (barres orange, Fig. 3) suggère une température optimale de 25 ° C avec une diminution significative de la durée, par rapport à celle à 20 et 30 ° C. Bien que la température aide à augmenter la pression osmotique et réduit ainsi la durée de l'étape d'hydratation et de différenciation, une fois que l'étape d'émergence commence et que l'embryon émerge dans la membrane d'éclosion, il semble avoir moins de tolérance aux températures plus élevées. Ainsi, une température intermédiaire de 25 °C était plus favorable au stade de la levée et nécessitait moins de temps pour la réalisation.

Une meilleure compréhension du processus d'éclosion est obtenue en examinant directement l'épuisement de la concentration en oxygène dissous (DDOC) de l'eau dans la chambre d'éclosion pour différentes températures et salinités. La Fig. 5 supplémentaire montre les courbes DDOC moyennes d'expériences en triple réalisées à chaque condition de température et de salinité. Dans l'ensemble, les résultats indiquent une corrélation positive entre la durée d'éclosion et la DDOC pour les salinités supérieures à zéro.

La DDOC totale, ou consommation totale d'oxygène, pour la période d'éclosion de 24 h est illustrée à la Fig. 4A, indiquant la présence d'une température optimale (25 ° C), car la consommation totale d'oxygène est plus élevée à cette température quelle que soit la salinité. La consommation totale d'oxygène a diminué de manière significative lorsque la température a augmenté de 20 à 30 °C, indépendamment de toute salinité. La salinité n'a abaissé la consommation totale d'oxygène de manière significative que lorsqu'elle a été augmentée de 25 à 75 ppm, quelle que soit la température ; cependant, il n'y a pas eu de changement significatif lorsque la salinité a été modifiée à 30 ° C, ce qui suggère une interaction significative entre la température et la salinité. Sur la base du poids des kystes initiaux secs utilisés, cette consommation totale d'oxygène variait de 5,81 × 10–7 à 3,47 × 10–5 mg O2/h/mg de poids sec, avec une température et une salinité variables, ce qui est comparable à la consommation d'oxygène d'Artemia37, et d'autres œufs de crustacés, comme Anomalocera patersoni65 et Pontella mediterranea66 signalés dans des études antérieures.

Consommation d'oxygène des kystes d'Artemia sous différentes températures et salinités. (A) Consommation totale d'oxygène ou DDOC total tout au long du processus d'éclosion sous différentes températures et salinités. (B) Taux de consommation d'oxygène (ROC) à différents stades d'éclosion : (i) hydratation, (ii) différenciation, (iii) émergence et (iv) stade d'éclosion. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart type (n = 3). Dans chaque catégorie de données (consommation totale d'oxygène, ou ROC dans les étapes d'hydratation et de différenciation), les moyennes qui ne partagent pas les lettres au-dessus des colonnes sont sensiblement différentes les unes des autres (ANOVA à deux facteurs avec test post-hoc de Bonferroni, p < 0,05) . À différentes températures testées, un ROC statistiquement significatif a été indiqué par * (ANOVA à deux voies avec test post-hoc de Bonferroni, p <0,05) et ** (ANOVA à une voie avec test post-hoc de Bonferroni, p <0,05) respectivement, alors que # indique une consommation totale d'oxygène statistiquement significative (ANOVA à deux facteurs avec test post-hoc de Bonferroni, p < 0,05).

Une compréhension plus détaillée des effets de la température et de la salinité sur le processus d'éclosion est obtenue en tenant compte de la consommation d'oxygène à chacune des quatre étapes de l'éclosion. Indépendamment de la salinité, le ROC a augmenté de manière significative pendant l'hydratation lorsque la température a été augmentée de 20 ° C [Fig. 4B(i)]. Le ROC a également diminué de manière significative avec une salinité accrue entre 25 et 75 ppt, ce qui reflète une activité plus faible en fonction de la durée plus longue (Fig. 3). D'autre part, bien que la salinité et la température aient diminué la durée de différenciation, le taux métabolique n'a pas été significativement affecté [Fig. 4B(ii)]. Au cours de la phase d'émergence, le ROC s'est avéré significativement affecté par la température, mais pas par la salinité au niveau p = 0, 05 (ANOVA à une voie), le ROC étant significativement diminué lorsque la température a été augmentée de 25 à 30 ° C (Bonferroni, p < 0,05, figure 4B(iii)). Nous notons que la signification statistique des données a été évaluée à l'aide d'une ANOVA à une voie avec le test post-hoc de Bonferroni en raison d'une émergence incomplète dans certaines conditions expérimentales (Fig. 3). La diminution de la consommation d'oxygène avec l'augmentation de la température peut indiquer un stress physiologique. Enfin, au stade de l'éclosion, le ROC a diminué par rapport à celui au stade de l'émergence, et il était maximum à 25 ° C quelle que soit la salinité, et la salinité n'a aucun effet sur le ROC à ce stade. Une augmentation similaire de la demande énergétique lors de l'émergence et une diminution de celle après l'éclosion ont été observées chez d'autres espèces de crustacés, comme Acartia tonsa67, Cherax quadricarinatus68 et Cancer pagurus69. Dans notre étude, la consommation d'oxygène par unité de poids sec des kystes d'Artemia au stade de l'émergence variait de 7,98 × 10–7 à 2,5 × 10–5 mg O2/h/mg de poids sec avec des températures et des salinités variables. Sur la base de la limite supérieure, la consommation d'oxygène lors de l'émergence du kyste d'Artemia est environ 5,54 fois inférieure à celle du gros crustacé Cancer pagurus69 et 0,43 fois supérieure à celle du petit crustacé Pontella mediterranea66. De plus, un ROC négatif a été observé au stade de l'éclosion dans certaines conditions de température et de salinité. À une salinité de 25 ppt à 20 °C et 30 °C, cela pourrait être dû à la très faible consommation d'oxygène des artémias éclos et à la perméation possible d'une très faible quantité d'oxygène à travers le PDMS (voir l'expérience de contrôle de la Fig. 2B). Cependant, à 0 ppt/30 °C, il a été observé que tous les nauplii mouraient après l'éclosion (pas de mobilité) potentiellement en raison de l'effet combiné de la salinité nulle et de la température élevée, et pour des raisons inconnues, la concentration en oxygène de l'eau augmentait pendant ce temps. Une explication possible pourrait être que pendant le processus d'éclosion, certains kystes ont été observés pour libérer des bulles d'air qui peuvent avoir été initialement piégées dans la coquille du kyste. Les nauplii vivants consommeraient cet oxygène supplémentaire des bulles d'air; mais, dans ce cas, parce qu'il n'y avait pas de nauplius vivants, la teneur en oxygène de l'eau d'éclosion a légèrement augmenté. Cependant, la raison exacte de cette augmentation de la teneur en oxygène est inconnue et nécessite une enquête plus approfondie.

La figure 5 illustre le taux d'éclosion (estimé à l'aide de l'équation (2)) des kystes d'Artemia dans notre plate-forme à différentes températures et salinités. Conformément aux travaux antérieurs, les résultats indiquent l'existence de conditions optimales27,30. Plus précisément, le taux d'éclosion a augmenté de façon spectaculaire lorsque la température est passée de 20 à 25 ° C, mais il n'y a pas eu de changement significatif à mesure que la température augmentait. De même, le taux d'éclosion a augmenté lorsque la salinité est passée de 0 à 25 ppt à 20 et 25 °C, et de 0 à 50 ppt à 30 °C, mais a ensuite diminué avec l'augmentation de la salinité. Un taux d'éclosion maximal a été observé à une température de 25 °C et une salinité de l'eau de 25 ppt (76,85 ± 14,22 %) conformément au ROC maximal mesuré [Fig. 4(iv)]. De plus, le ROC mesuré a indiqué que les très faibles taux d'éclosion à salinité nulle et 20 ° C ne reflètent pas nécessairement des conditions hostiles (puisque nous observons une activité) mais que la durée de 24 h est insuffisante.

Calcul du taux d'éclosion sur puce d'Artemia à différentes salinités et températures d'eau. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart type (n = 3). Les moyennes qui ne partagent pas la même lettre au-dessus des colonnes sont sensiblement différentes les unes des autres (ANOVA à deux facteurs avec Bonferroni, p < 0,05).

La présente approche, dans laquelle l'ensemble du processus d'éclosion est surveillé en temps réel, fait progresser de manière unique la compréhension des relations entre les paramètres abiotiques, les caractéristiques du stade (durée, ROC) et le taux d'éclosion. Pour quantifier ces paramètres, nous avons mis en place une corrélation de Pearson. Nous notons d'abord que bien que le ROC ait été significativement affecté par la température, la salinité ou les deux, seul le ROC au stade de l'éclosion avait une association statistiquement significative (corrélation positive) avec le taux d'éclosion. En revanche, seule la durée de différenciation est significativement corrélée au taux d'éclosion (corrélation négative).

Des corrélations négatives entre le taux d'éclosion et l'hydratation et la durée du stade de différenciation et une corrélation positive entre le taux d'éclosion et la durée du stade d'éclosion ont été observées. Le taux d'éclosion était maximum lorsque la température et la salinité étaient respectivement de 25 °C et 25 ppt. À une température ou une salinité inférieure ou supérieure parmi les conditions testées, l'étape d'hydratation et de différenciation a pris plus de temps et l'étape d'éclosion était plus courte. De même, la consommation d'oxygène est corrélée positivement avec le taux d'éclosion au stade de l'hydratation et de l'éclosion, mais négativement avec le taux d'éclosion au stade de la différenciation. À une température de 25 °C et une salinité de 25 ppt, la consommation d'oxygène était relativement élevée au stade de l'hydratation, plus faible au stade de la différenciation et très élevée au stade de l'éclosion. Ce schéma s'est inversé à des températures ou des salinités testées très basses ou très élevées. Ces résultats montrent que la température et la salinité affectent de manière significative l'ensemble du processus d'éclosion. L'éclosion la plus élevée est obtenue dans ces conditions de température et de salinité favorables, lorsque la majorité des kystes s'hydratent et retrouvent un taux métabolique plus élevé dans un laps de temps plus court pendant la phase d'hydratation, dépensent moins d'énergie pendant la phase de différenciation et la complètent plus rapidement. Dans ces conditions optimales, les kystes passeront plus de temps au stade de l'éclosion, ce qui entraînera l'éclosion d'un plus grand nombre de kystes et une plus grande consommation d'oxygène.

Dans ce travail, nous avons démontré que la mesure des taux métaboliques en temps réel et les changements morphologiques correspondants peuvent offrir une compréhension mécaniste approfondie de la façon dont les paramètres abiotiques affectent le processus d'éclosion d'Artemia. En nous concentrant sur la température et la salinité (deux paramètres environnementaux importants qui sont également sensibles au changement climatique), nous avons mesuré le comportement respiratoire, la progression de l'éclosion ainsi que le nombre résultant d'Artemia éclos sous des niveaux de température et de salinité distincts tout au long d'une période de temps prédéterminée. Bien que les habitats d'Artemia soient limités par l'hypersalinité, cette étude peut faire la lumière sur les impacts probables de la température et de la salinité sur le processus d'éclosion d'autres espèces de crustacés plus largement répandues.

Conformément à des études antérieures, des salinités extrêmes (faibles ou élevées) et des températures basses sont observées pour inhiber l'éclosion d'Artemia, vérifiant l'existence de conditions d'éclosion optimales26,27,28,29,30,31. Cependant, alors que ces études précédentes se concentrent principalement sur les mesures finales du taux d'éclosion, nous avons ici établi des relations entre le taux d'éclosion et la progression de l'éclosion et du comportement respiratoire tout au long du processus. Par exemple, nous démontrons qu'un facteur clé affectant l'éclosion d'Artemia sur une période de 24 h est la durée de l'étape de différenciation, qui s'avère inversement proportionnelle au taux d'éclosion. Dans l'ensemble, la durée de différenciation (barres bleues, Fig. 3) diminue avec l'augmentation de la salinité et de la température, sauf à des salinités très élevées. Sur la base d'une compréhension de l'étape de différenciation, il est possible que cette relation soit liée à une production accrue de glycérol qui accélère la fracture de la coquille caractérisant le début de l'émergence. Bien que la validation de cette hypothèse soit laissée à des travaux futurs, nous montrons que les expériences actuelles mettent en évidence les principaux domaines d'intérêt pour comprendre la relation complexe entre l'environnement et la santé des animaux aquatiques. Un lien crucial entre la température, la salinité et la réactivation du métabolisme des kystes dormants a également été clairement démontré en comparant la progression de l'hydratation à la loi de Van't Hoff.

La présente approche expérimentale a été rendue possible grâce au développement d'une nouvelle plate-forme microfluidique avec capteur d'oxygène intégré, dans laquelle les changements physiques dans les kystes d'Artemia pourraient également être enregistrés à l'aide d'un microscope optique. Un contrôle environnemental précis est obtenu à l'aide d'un réchauffeur avec une boucle de rétroaction et une puce de comptage automatisée est conçue pour éliminer les erreurs associées au manque de contrôle environnemental rigoureux et au calcul manuel de l'éclosion. En plus d'offrir un regard plus approfondi sur les processus biologiques, l'utilisation généralisée de systèmes automatisés avec un contrôle environnemental précis normalise les expériences, ce qui se traduit par une comparaison croisée plus informative dans la littérature. Ainsi, la présente approche devrait avoir une applicabilité plus large dans la recherche sur le zooplancton et les larves de poissons, y compris dans des conditions environnementales abiotiques/biotiques variées et des contaminants aquatiques.

Les ensembles de données sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail est soutenu par la National Science Foundation (numéro de prix : 2038484, année : 2020). Les graphiques ont été tracés à l'aide d'OriginPro 2022b (https://www.originlab.com/). Les schémas ont été créés à l'aide de Biorender (https://biorender.com/).

Département de génie mécanique et des matériaux, Florida International University, 10555 W Flagler St, Miami, FL, 33174, États-Unis

Preyojon Dey et Alicia Boymelgreen

Department of Fisheries, Animal and Veterinary Science, University of Rhode Island, Kingston, RI, 02881, États-Unis

Terence M. Bradley

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PD : conceptualisation, méthodologie, enquête, analyse formelle, visualisation, rédaction - ébauche originale. TB : conceptualisation, supervision, analyse formelle, rédaction—révision et édition, acquisition de financement. AB : conceptualisation, supervision, analyse formelle, rédaction-révision et édition, acquisition de financement.

Correspondance avec Alicia Boymelgreen.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Dey, P., Bradley, TM et Boymelgreen, A. L'impact de certains facteurs abiotiques sur le processus d'éclosion d'Artemia grâce à l'observation en temps réel des changements d'oxygène dans une plate-forme microfluidique. Sci Rep 13, 6370 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32873-1

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Reçu : 24 janvier 2023

Accepté : 04 avril 2023

Publié: 19 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-32873-1

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